Поры, каналы и переносчики

Фосфорилирование белка стабилизирует конформацию с низким сродством к Na +; при этом места связывания ионов обращены наружу. Это способствует переходу Ei-P -» Ег-Р, в результате которого и осуществляется перенос.

В форме Ег-Р места связывания ионов обращены во внеклеточную среду; эта конформация обладает высоким сродством к К+, который связывается, катализирует дефосфорилирование и остается «спрятанным» внутри комплекса. Обратите внимание, что Na+ необходим для быстрого фосфорилирования, а К+ -- для быстрого дефосфорилирования. Ванадат связывается с формой Е2, возможно, как некий аналог переходного состояния фосфата. У других ферментов Е^г-типа, например Са2 + -АТРазы, форма Ег-Р дефосфорилируется и переходит в форму Ei, которая в свою очередь переходит в незагруженную форму.

Лимитирующей стадией каталитического цикла является, по всей вероятности, освобождение К+ и переход его из связанного с ферментом состояния в свободное. Этот процесс стимулируется связыванием АТР с сайтом, обладающим низким сродством. Следовательно, АТР выполняет две разные функции, выступая в качестве субстрата и аллостерического эффектора. Сколько мест связывания АТР имеет фермент, пока неясно.

Определена аминокислотная последовательность нескольких АТРаз Е|Е2-типа, включая Na+/К+-АТРазу из не-

скольких источников, Са2 + -АТРазу, Н + -АТРазу из плазматической мембраны дрожжей и Neurospora crassa и К+-АТРазу из S. faecalis. Исходя из профилей гидрофобности, были построены модели, согласно которым эти белковые комплексы содержат 6, 8 или 10 трансмембранных а-спиральных сегментов. Некоторые участки полипептидов, в том числе и сегмент; содержащий сайт фосфорилирования, в значительной степени гомологичны. Все белки имеют большую гидрофильную петлю, содержащую домены, с которыми, по всей вероятности, связываются нуклеотиды и где происходит фосфори-лирование.

У Са2 * -АТРазы один расщепляемый трипсином сайт, чувствительный к конформационному переходу Е| -¦ Ег, находится в «трансдукционном» домене. Исследовалось также связывание Са2+ с ферментом; было высказано предположение, что транспорту Са2+ предшествует связывание двух ионов Са2+ с определенными участками внутри белкового комплекса. По всей вероятности, у Са2 + -АТРазы места связывания Са2 + с высоким сродством располагаются на значительном удалении от места связывания нуклеотидов, однако эту гипотезу нужно еще проверить. Основные особенности строения Са2 +-АТРазы, представленные на рис. 8.13, согласуются с данными электронной микроскопии, согласно которым этот белковый комплекс сильно выступает из бислоя в цитоплазму. Вероятно, в условиях in vivo АТРазы Е|Ег-типа агрегируют, образуя по меньшей мере димеры, но подтвердить данное предположение экспериментально очень трудно. Тем не менее очевидно, что мономеры также способны к катализу, по крайней мере в некоторых случаях.

Определена аминокислотная последовательность меньшей @-субъединицы Na +/К +-АТРазы. Было высказано предположение, что эта субъединица имеет одну или четыре трансмембранные а-спирали.

В заключение отметим, что благодаря легкости клонирования этих мембранных АТРаз и возможности использования разных экспериментальных подходов эти системы являются отличным объектом для применения к ним направленного мутагенеза и других генетических методов. Подобные методы уже применяются в исследованиях FiFo-АТРаз.

АТРазы Fq-ТИПА ИЗ МИТОХОНДРИЙ, ХЛОРОПЛАСТОВ И БАКТЕРИИ

Большинство бактерий, а также митохондрии и хлоропласты содержат родственные АТРазы FiFo-типа, которые используют трансмембранный протонный электрохимический градиент для синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата. В физиологических условиях эти ферменты являются АТР-синтазами. Они содержат от 8 до 13 различных субъединиц и, таким образом, являются гораздо более сложными структурами, чем АТРазы EiE2-THna из плазматических мембран. АТРазы FiFo-типа состоят из двух частей: 1) гидрофильного глобулярного Fi-комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТРазы, и 2) мембраносвязанного Fo-kom-плекса, который функционирует как Н+-проводящий канал. F|- и Fo-комплексы могут отсоединяться друг от друга, а после очистки их можно реконструировать с восстановлением функциональной активности.

Fi-комплекс из Е. coli содержит пять субъединиц в стехиометрии m/Sj-yot. Между тремя парами а$ в составе Fi наблюдается асимметрия, возникающая, по всей вероятности, в результате асимметричиых взаимодействий с другими субъединицами. В составе каждого комплекса имеется по три каталитических центра, и для быстрого оборота фермента необходимо, чтобы АТР был связан более чем с одним местом связывания. Для объяснения механизма катализа были построены различные модели с чередованием мест связывания, в частности модель, согласно которой в ходе катализа происходит физическое вращение частей фермента. Возможно, в связывании Fi- и Fo-компонентов фермента в мембране участвуют 5- и е-субъединицы.

Fo-комплекс из фермента Е. coli устроен достаточно просто, он содержит только три субъединицы в стехиометрии а\ЬгСю. Все эти субъединицы необходимы для формирования Н+ -проводящего канала. Полагают, что Н + -проводящая часть Fo образована а-спиралями из множественных копий с-субъедииицы. По всей вероятности, эта субъединица содержит пять трансмембранных а-спиралей, в то время как а- и Ь-субъединицы -- по одной. Результаты, полученные с помощью генетических методов, согласуются с предположением, согласно которому погруженные в мембрану части всех трех субъединиц играют важную роль в обеспечении протонной проводимости.

Изучение этой системы показывает нам, сколь успешным может быть применение генетических методов для исследования строения мембранных белков, для которых отсутствуют кристаллографические данные высокого разрешения. Очень важно выяснить, приводит ли замена единственной аминокислоты в таком белке к конфор-мационным изменениям, которые скажутся на катализе. По-видимому, результат такой замены сильно зависит от природы переносчика. Например, как мы уже обсуждали, очень обнадеживающими в этом отношении являются данные, полученные для лактоэопермеазы. Очевидно, в следующем десятилетии в изучении взаимосвязи между структурой и функцией мембранных белков главную роль будут играть различные генетические методы, в частности направленный мутагенез.

Рассмотрим результаты, прлученные к настоящему времени для FiFo-АТРазы из Е. coli.

Наличие многочисленных мутантных по Ј-субъединице форм позволяет идентифицировать участок, являющийся, по всей вероятности, каталитическим нуклеотидсвязывающим доменом. Исследование мутантных форм показало также, что между а- и /3-субъединицами имеется конформационное сопряжение.

Показано, что мутантные по е-субъединице формы неспособны к сопряжению транспорта Н + с катализируемой комплексом Fi АТРазной активностью, а также к связыванию комплексов F, и Fo.

3. Показано, что определенные аминокислотные остатки в субъединицах а, Ь и с опосредуют протонную проницаемость; имеющиеся генетические данные позволяют предположить, что субъединица b непосредственно контактирует в мембране с субъединицами а и с.

Связаны ли все эти явления с локальными или глобальными конформационными изменениями, покажут дальнейшие исследования. Пока же мы не может сказать определенно, как происходит сопряжение гидролиза АТР и транспорта Н+ при работе АТРазы FiFo-типа, а также с чем связана протонная проводимость.

Важными в этом отношении могут оказаться данные о том, что цитоплазматическая мембрана анаэробной бактерии Propionigenium modestum содержит Na+-зависимую АТРазу FiF^vrHna. Если этот фермент работает как первичный АТР-зависимый Na+-насос, то логично предположить, что механизм функционирования Н+ -АТРазы и Na +-АТРазы одинаков. Например, это позволит исключить модели прямого сопряжения.

ТРИ ДРУГИХ КЛАССА ПЕРЕНОСЧИКОВ

Помимо АТР-зависимых активных переносчиков Е1Е2- и F|Fo-типов есть еще три класса активных переносчиков, использующих свободную энергию гидролиза макроэргических фосфатных связей. О реальных механизмах транспорта или сопряжения в этих системах известно немного. Отметим несколько интересных их особенностей.

1. Бактериальные фосфотрансферазы. Этот комплекс был обнаружен только в бактериях; он катализирует транспорт Сахаров, таких, как глюкоза и маннитол. Уникальной особенностью этой системы является то, что транспорт сахара сопровождается его фосфорилированием. Получаемое фосфатное производное сахара уже не может служить субстратом для переносчика в бактериальной мембране, и таким образом предотвращается обратный поток сахара через эту систему. Вспомним, что в переносчиках EiE2-THna фосфорилирование переносчика стабилизирует форму с низким сродством к переносимому веществу, что также препятствует обратному переносу транспортируемых веществ.

Конечным донором фосфата в фосфотрансферазной системе является фосфоенолпируват. Фосфат переносится специфической последовательностью растворимых фосфорилированных интермедиа-тов в цитоплазму к мембраносвязанному транспортному белку, называемому фермент II или ЕИ. Существует группа ферментов ЕП-типа, специфичных к разным сахарам, но обладающих сходной первичной структурой. По всей вероятности, внутри мембраны ферменты ЕП-типа образуют димеры. Высказывалось предположение, что они формируют каналы. Эти белки чувствительны к реагентам, действующим на сульфгидрильные группы, и к окислению, что может играть важную роль в условиях in vivo. Немного известно о том, каким образом фосфорилированные ферменты ЕП-типа осуществляют транспорт и фосфорилирование Сахаров. Разумной представляется модифицированная модель с чередованием конформации и единственным местом связывания.

2. Бактериальные периплазматические транспортные системы. В дополнение к системам симпорта и фосфо-трансферазной системе бактерии имеют еще одну систему активного транспорта растворимых веществ, которая используется для различных аминокислот и Сахаров. Так, охарактеризованы системы, специфичные к гистидину и мальтозе. К сожалению, биохимические данные, которые могли бы дополнить интенсивные генетические исследования мембраносвязанных компонентов этих систем, весьма немногочисленны. Уникальной особенностью этих систем является то, что они содержат субстратспеци-фичные связывающие белки, локализованные в периплазматиче-ском пространстве. Роль этих белков заключается в связывании переносимого вещества и последующей передаче его собственно транспортирующей системе цитоплазматической мембраны. Специфичность системы определяется как связывающими белками, так и мембраносвязанными компонентами. Цитоплазм этический мембранный компонент содержит три субъединицы, две из которых являются трансмембранными белками, а третья, по всей вероятности, прочно связана с цитоплазматической стороной мембраны. Как оказалось, этот третий компонент транспортного комплекса содержит место связывания нуклеотидов, где, как предполагается, происходит гидролиз АТР -- реакция, являющаяся движущей силой активного транспорта. Однако прямые данные, подтверждающие эту гипотезу, отсутствуют. Практически ничего не известно о механизме транспорта, за исключением того, что для него необходим растворимый связывающий белок.

По всей вероятности, эта система аналогична транспортной системе млекопитающих, которая используется ими для выведения из клетки нежелательных лекарственных веществ и обеспечивает множественную лекарственную устойчивость. По-видимому, транспорт разных лекарственных веществ единственной транспортной системой опосредуется группой немембранных связывающих белков. Сходное предположение высказывалось относительно кодируемой плазмидой бактериальной транспортной системы, которая выводит из клеток арсенаты. Предполагается, что эти системы также используют гидролиз АТР в качестве источника энергии, однако это не было прямо продемонстрировано.

3. Вакуолярные Н + -АТРазы. В эукариотических клетках имеются Н + -АТРазы, локализованные в мембранах различных внутренних органелл. Эти АТРазы отличаются от АТРаз как FiFo-, 'так и Е|Ег-типов. В некоторых случаях функцией Н + -АТРазы является транспорт протонов внутрь той или иной органеллы для закисления ее содержимого. Например, известно, что низкий рН в эндоцитозных пузырьках необходим для отсоединения лигандов от их рецепторов, происходящего вслед за эндоцитозом. Хотя достоверные данные о структурном родстве этих Н +-АТРаз пока не получены, известно, что все они 1) содержат более одной субъединицы; 2) не образуют фосфорилированного интермедиата; 3) нечувствительны к ванадату; 4) транспортируют Н +. Однако все эти вопросы требуют дополнительных биохимических и структурных исследований.

Активные транспортные системы, сопряженные с процессом переноса электронов или поглощением света

Имеется несколько интересных примеров активных транспортных систем, которые используют для своей работы изменение окислительно-восстановительного состояния связанной с белком просте-тической группы или энергию света, поглощаемого простетической группой. В целом транспорт и в этом случае подчиняется закономерностям, обсуждавшимся ранее. Для его осуществления нужно стабилизировать некую нестабильную форму белка, которая является необходимым промежуточным соединением в транспортном цикле. Способы стабилизации могут быть различными: фосфорилирование белка или даже связывание АТР, о чем мы уже говорили.

ЦИТОХРОМ с-ОКСИДАЗА: ПРОТОННЫЙ РЕДОКС-НАСОС

Этот белок является наиболее ярким примером фермента, который, функционируя как ионный насос, сопрягает ионный транспорт и реакции переноса электронов. Оксид аза катализирует окисление цитохрома с, локализованного в межмембранном пространстве митохондрий, и восстановление Ог до воды. В этой реакции участвуют четыре иоиа Н + на каждую молекулу Ог; протоны поступают из матрикса митохондрий. Соотвтетствеино на каждый электрон, проходящий через систему, через внутреннюю митохон-дриальную мембрану переносится по меньшей мере один протон. Фермент содержит две простетические группы гема а, а также два или три атома меди и один атом цинка. Цитохром с-оксидаза -- очень консервативный фермент, мало изменившийся в ходе эволюции. Ферменты, сходные с митохондриальной цитохром с-оксидазой, обнаруживаются во многих бактериях. Субъединичный состав комплекса сильно варьирует: он содержит от двух субъединиц у некоторых бактерий до 12 в оксидазе митохондрий сердца быка. По всей вероятности, в переносе Н+ непосредственно участвует одна субъединица, ио окончательно этот вопрос еще не выяснен. Согласно данным электронной микроскопии, окси-даза не только пронизывает бислой, ио и выходит на внешнюю поверхность мембраны. К сожалению, до сих пор окончательно не установлен не только механизм ионного транспорта, но и расположение простетических групп в ферменте.

Для описания работы оксидазы можно использовать очень простую модель четырех состояний. В этой модели постулируется, что место связывания Н+ доступно с одной стороны мембраны, когда ион металла в составе простетической группы восстановлен, и обращено к противоположной стороне мембраны, когда он окислен. Значения рК в окисленном и восстановленном состояниях также могут различаться. Существенно, что в ходе реакций переноса электронов происходит поочередная стабилизация двух конформации фермента, в которых место связывания Н+ обращено к разным сторонам мембраны. Однако механизм этого явления на молекулярном уровне не установлен.

В заключение следует отметить, что существует по меньшей мере один пример редокс-зависимого транспорта Na+. Это означает, что такого рода системы не ограничиваются переносом только ионов Н +.

БАКТЕРИОРОДОПСИН: Н+ НАСОС, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙ ЭНЕРГИЮ СВЕТА

Функция бактериородопсина состоит в активном транспорте протонов через бактериальную цитоплазматическую мембрану. Поглощение света связанной простетической группой ретиналя запускает последовательность событий, которые поддаются регистрации оптическими методами. Эти реакции сопряжены с переносом двух Н + на каждый цикл работы комплекса. Галородопсин, белок из той же бактерии, использует аналогичный механизм для активного транспорта CI ~. По всей вероятности, мономерная форма бактериородопсина является самостоятельной функциональной единицей, хотя внутри мембраны он находится в виде тримера. Показано, что ретиналь локализован примерно в середине бислоя. Предполагается, что для него характерен прямой механизм сопряжения. Структура белка с семью параллельными а-спиралями, пронизывающими мембрану, не дает ответа на вопрос о существовании какого бы то ни было канала. Как ион Н + достигает ретина-ля -- неизвестно, но, без сомнения, это один из вопросов, который можно будет решить, используя методы сайт-специфического мутагенеза.

В лаборатории Кораны при помощи сайт-специфического мутагенеза были получены многочисленные мутантные формы бактериородопсина. Оказалось, что большинство из них, в том числе и с замещением каждого из 11 остатков тирозина, сохраняют нормальную или близкую к нормальной транспортную активность. Эти данные служат еще одной иллюстрацией использования генетических методов исследования структуры и механизма действия белкового комплекса.

Мембранные поры, создаваемые экзогенными агентами

Мы рассматривали процессы регуляции клеткой потоков веществ через мембрану при помощи различных эндогенных транспортных систем. Однако в условиях in vivo поры в биомембранах могут образовываться с помощью экзогенных веществ, а также под влиянием различных воздействий. Многие пептиды и белки, создавая неселективные поры в плазматической мембране клетки-мишени, убивают клетку. Мы рассмотрим разные способы образования пор в биомембранах под действием специфических агентов или физических факторов.

ТОКСИНЫ -И ЦИТОЛИТИЧЕСКИЕ БЕЛКИ

В природе существуют различные водорастворимые токсины, взаимодействующие со специфическими клетками-мишенями. Как минимум, токсины должны узнавать определенные рецепторы на наружной поверхности мембраны и каким-то образом проникать в цитоплазму. Одни токсины способствуют высвобождению в цитоплазму фермента, оказывающего летальное воздействие, другие просто образуют в мембране неселективные поры, давая возможность метаболитам, ионам, а иногда и макромолекулам выйти из клетки. Наиболее интересным представляется вопрос о том, как эти водорастворимые гидрофильные белки спонтанно встраиваются в мембранный бислой. Рассмотрим основные свойства некоторых из токсинов, образующих поры в биомембранах.

Колицины представляют собой одиночные полипептиды, и некоторые из них образуют неселективные каналы в цитоплазматической мембране чувствительных штаммов Е. coli. Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы колицины Е1 и А. Очищенные белки спонтанно формируют в плоских мембранах потенциалзависимые каналы, достаточно большие, чтобы пропускать такие молекулы, как NAD+. Недавно был выделен и охарактеризован каналообразующий участок, находящийся на С-конце колицина Е1. Его аминокислотная последовательность отлична от таковой у интегральных мембранных белков. Под действием напряжения происходит переход образуемой колицином Е1 поры из открытого состояния в закрытое, что сопровождается переносом через мембрану значительного количества белка. Пору образует только одна молекула колицина.

Дифтерийный токсин представляет собой одиночный полипетид, также продуцируемый бактериями, который при связывании с поверхностными рецепторами определенных клеток образует в мембране канал и высвобождает в цитоплазму фермент, оказывающий летальное действие. Один фрагмент токсина формирует в мембране поры, размер которых достаточно велик, чтобы через них мог пройти сегмент токсина, обладающий ферментативной активностью. Однако окончательно не доказано, что именно таков механизм переноса. Сходные результаты были получены и для токсинов, вызывающих столбняк и ботулизм. Холерный токсин состоит из двух субъединиц, при этом субъединица В образует в мембране олигомер с центральным каналом, который используется для переноса А-субъединицы, обладающей ферментативной активностью. С помощью рентгеновской кристаллографии была установлена структура экзотоксина А из Pseudomonas, близкого по строению к дифтерийному токсину, что,однако, не помогло выяснить механизм спонтанного встраивания этого растворимого белка в мембрану и образования поры.

Комплекс комплемента и порообразующих белков из цито-токсичных Т-клеток. Эти родственные белки сыворотки агрегируют, образуя большие поры в мембране клеток-мишеней. Первичным компонентом этого комплекса является белок С9, который после нескольких актов самосборки с участием других компонентов системы комплемента формирует большую пору, в результате чего происходит лизис клетки. Этот белок интенсивно изучали с использованием модельных систем плоских мембран и липосом. Однако механизм формирования поры на молекулярном уровне до сих пор неизвестен.

Примером другого токсина, который агрегирует в мембране, образуя большую пору, является а-токсин из S. aureus. Известно, что он образует гексамерную структуру, претерпевающую при связывании с мембраной конформационные изменения.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ПРИ ПОМОЩИ ДЕТЕРГЕНТОВ

Сапонин и дигитонин взаимодействуют с холестеролом внутри мембран и образуют агрегаты в виде крупных пор. Эти агенты широко используются для формирования больших отверстий в плазматических мембранах клеток, через которые внутрь клеток могут проходить как небольшие молекулы, так и макромолекулы.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ПРИ ПОМОЩИ ОСМОТИЧЕСКОГО ШОКА

Под действием осмотического шока в мембранах образуются отверстия. Так, в мембране эритроцита появляется одно большое отверстие диаметром ~ 1 мкм, размер которого затем уменьшается до 14 280 А. Конечный размер зависит от состава буфера. Детали формирования и строения этого гемолитического отверстия неизвестны.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ

Поры в плазматической мембране животных клеток могут образовываться и под действием электрического поля. Исследования, проведенные на тенях эритроцитов, показали, что вблизи катода происходит формирование нестабильных больших пор, которые затем быстро уменьшаются до 10 А. Образование пор под действием электрического поля иногда используют для инициации слияния клеток. Связано ли наблюдаемое порообразование со структурными изменениями, вызывающими слияние мембран, неизвестно.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ЗА СЧЕТ ОБРАЗОВАНИЯ ДЕФЕКТОВ УПАКОВКИ МЕМБРАННЫХ КОМПОНЕНТОВ

Любая обработка, которая изменяет упаковку липидов и белков в мембране, может привести к нарушению функции мембраны как барьера для гидрофильных веществ. Например, проницаемость ли-посом при температуре фазового перехода существенно повышается, становясь эквивалентной проницаемости поры диаметром 18 л. К аналогичному эффекту может привести и агрегация белков как в реконструированных протеолипосомах, так и при перекрестном сшивании мембранных белков внутри биомембран. Эти явления вряд ли участвуют в естественных физиологических процессах, однако они указывают на то, что какие-то изменения в организации мембранных компонентов несовместимы с функцией мембраны.

Резюме

Транспорт большинства растворимых молекул через биологические мембраны опосредуется переносчиками или канальными белками. Каналы облегчают транспорт ионов через мембрану, и перенос через них осуществляется очень быстро. Такие высокие скорости транспорта ионов связаны с тем, что канальные белки не претерпевают конформационных изменений при переносе иона с одной стороны мембраны на другую. Столь быстрый транспорт ионов обусловливает такую высокую мембранную проводимость, что удается измерить ионный ток через отдельный канал. В отличие от этого переносчики, которые участвуют в транспортном цикле, претерпевают конформационные изменения. При этом место связывания переносимого вещества бывает обращено сначала к одной, а затем к противоположной стороне мембраны. Как правило, опосредованный переносчиками транспорт веществ через мембрану происходит на несколько порядков медленнее, чем транспорт по каналам.

Пассивные переносчики просто облегчают диффузию веществ через мембрану, в то время как активные используют энергию для транспорта веществ против концентрационного градиента. Известны активные переносчики, сопрягающие транспорт вещества с переносом электронов, гидролизом АТР или фосфоенолпирувата, поглощением света или совместным транспортом иона.

Существуют группы каналов и переносчиков, которые объединяют функционально различающиеся белки, имеющие сходное строение. Близость их аминокислотных последовательностей позволяет предположить, что, несмотря на различия в субстратной специфичности, каналы и переносчики одной группы могут фукнционировать по сходному механизму. По-видимому, белковые комплексы образуют в мембране пору, находящуюся в центре белкового кластера, который содержит несколько копий одинаковых или близкородственных полипептидов или доменов одного полипептида. Эти поры могут открываться или закрываться в ответ на химический или электрический сигнал.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5