Поры, каналы и переносчики

Для описания работы ионных каналов и различных видов

переносчиков разработано много моделей и схем. Хотя кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, особенно в том, что касается кинетических свойств каналов, ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.

АНАЛИЗ СТАЦИОНАРНОГО СОСТОЯНИЯ

Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой, то также и возвращаться обратно. Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны. Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию для процесса, протекающего в любом направлении.

Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка -- только с одной стороны. В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Измеряют поток как функцию.

Меченый субстрат нахоится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной стороне. Измеряют поток как функцию ^uc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток. Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a „uc изменяется. В этом случае измеряют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют Ктах и Км, которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их. Как и в классических работах по энзимо-логии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.

Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества.

Дополнение 8.2. Исследование транспорта в стационарном состоянии с использованием мутантной лактоэопермеазы из Е. coll

Как пример использования описанных выше подходов рассмотрим изучение транспорта в стационарном состоянии, осуществляемого одной из мутантных форм лактоэопермеазы, в которой остаток Glu в положении 325 заменен на Ala. На рис. 8.11 этот остаток находится в спирали 10. При измерениях использовали радиоактивную лактозу, при этом накопление лактозы изучали на интактных клетках, а выведение, встречный поток и обмен лактозы -- на цитоплазматических мембранных везикулах с правильной ориентацией. Пермеаза дикого типа катализирует сим-порт /3-галактозидов и Н+. В присутствии протонного электрохимического градиента пермеаза использует свободную энергию, высвобождающуюся при переносе Н + по градиенту, для накопления /3-галактозидов против концентрационного градиента.

При замене остатка Glu-325 на Ala активный транспорт лактозы прекращается. Для измерения накопления лактозы использовали интактные клетки, в которых пермеаза дикого типа была заменена мутантной пермеазой. Для этого к суспензии дышащих клеток добавляли -лактозу и измеряли количество лактозы, накапливаемой клетками, в зависимости от времени. Приблизительно через 3 мин перенос лактозы достигал максимальной величины, но в клетках с мутантной пермеазой оставался пренебрежимо малым. Для изучения выведения лактозы инкубировали мембранные пузырьки в течение нескольких часов в присутствии высоких концентраций радиоактивной лактозы, а затем аликвоты переносили в среду без лактозы. Быстро фильтровали везикулы, измеряли их радиоактивность с помощью сцин-тиляционного счетчика и определяли скорость потери лактозы везикулами. Время полувыведения для контрольных везикул составляло 10 с, а для пузырьков, содержавших мутантную пермеазу, оно было равно 540 с. Мутантная пермеаза неспособна транспортировать лактозу как в прямом, так и в обратном направлениях.

Совершенно другие результаты были получены, однако, при измерении равновесного обмена. Эти измерения проводят точно так же, как и измерения по выведению лактозы, только нагруженные лактозой везикулы помещают в среду, содержащую немеченую лактозу в такой же концентрации. В этих опытах скорости выведения -лактозы из везикул, содержавших в одном случае пермеазу дикого типа, в другом -- мутантную, были идентичными. Эти эксперименты показывают, что, хотя мутантная пермеаза не может осуществлять полный цикл транспорта лактозы, она способна изо-меризоваться в загруженную форму, что делает возможным трансмембранный обмен лактозы. Сходным образом мутантная пермеаза нормально функционирует в опытах по измерению встречного потока. При таком подходе везикулы нагружают немеченой лактозой, разводят средой, содержащей -лактозу в низкой концентрации, и измеряют поток меченой лактозы внутрь везикул. Этот подход также показал, что связанная с лактозой форма пермеазы нормально изомеризуется и осуществляет трансмембранный обмен лактозы.

Приведенные выше данные позволили сделать вывод о том, что мутантная пермеаза, содержащая А1а-325, не может депротониро-ваться. Таким образом, пермеаза оказывается дефектной по всем сопряженным транспортным процессам, в которых Н+ и лактоза переносятся вместе в цикле, требующем наличия депротонирован-ной формы переносчика для изомеризации.

Другие примеры использования такого рода подходов более подробно рассмотрены в отличной книге Штейна.

РЕГИСТРАЦИЯ ТОКА, ПРОТЕКАЮЩЕГО ЧЕРЕЗ ОДИНОЧНЫЙ КАНАЛ: ВСТРАИВАНИЕ В ПЛОСКИЕ МЕМБРАНЫ И МЕТОД ПЭТЧ-КЛАМП

Электрический ток, возникающий при быстром перемещении ионов через канал, можно легко измерить. Например, реконструированный никотиновый ацетилхолиновый рецептор -- химический воротный катионселективный канал в постсинаптических мембранах, открывание и закрывание которого регулируется с помощью химических веществ, -- имеет проводимость в открытом состоянии 45 пСм при концентрации NaCl с одной стороны мембраны 0,5 М. Это -- обычное значение проводимости для ионных каналов. При этом при напряжении на мембране 100 мВ через каждый канал проходит ток 4,5 пА, или 2,7-107 ионов/с. Этот ток легко зарегистрировать с помощью соответствующей электронной аппаратуры. Следовательно, ток через единичный канал можно прямо измерить, если фоновый ток через мембрану достаточно мал. Для того чтобы исследовать свойства индивидуальных канальных молекул, необходимо измерить ток через участок мембраны в условиях, когда одновременно открыто не более одного канала. Для этого можно использовать искусственную систему, когда в плоскую мембрану встроены одиночные канальные белки. Можно также воспользоваться методом пэтч-кламп. В основе метода лежит сделанное в 1979 г. открытие, показавшее, что если чистую стеклянную микропипетку прижать к клеточной мембране и слегка втянуть воздух в пипетку, то на ее конце образуется очень тонкая, но прочная мембранная пленка. Это позволяет получать вольт-амперные характеристики любых каналов, находящихся на этом небольшом участке мембраны. Фоновый ток обычно бывает значительно меньше 1 пА, так что ток через индивидуальный канал можно легко измерить. Применение этой техники произвело настоящую революцию в изучении ионных каналов, позволив детально исследовать работу разнообразных каналов из различных мембран. На рис. 8.3 схематически показаны четыре модификации метода пэтч-кламп. В рамках данного метода можно изменять состав раствора как с одной, так и с обеих сторон мембраны, можно измерять проводимость единичных каналов, изучать энзимологию единичных молекул. Все это делает метод пэтч-кламп необычайно мощным.

Чтобы оценить возможности данного подхода, рассмотрим запись работы единичного ацетилхолинового рецепторного канала, встроенного в бислой. Ворота индивидуальных каналов могут спонтанно открываться и закрываться. Каждое отклонение записи вниз соответствует открыванию канала. Ток, текущий через открытый канал, можно измерить, а это дает возможность определить проводимость единичного канала. Время, в течение которого каждый канал остается открытым, также легко измерить. Получаемое при этом распределение времени жизни канала в открытом состоянии прямо связано с константой скорости закрывания канала. Для самой простой модели, когда имеется одно открытое и одно закрытое состояние,

распределение времени жизни канала описывается экспоненциальной функцией с характерным временем т, равным величине, обратной константе скорости первого порядка для закрывания канала. Когда функция распределения времени жизни канала в открытом состоянии отличается от простой экспоненциальной зависимости, как в случае ацетилхолинового рецептора, для объяснения экспериментальных данных необходимо использовать более сложные состояния. Можно изучать влияние на работу канала различных химических агентов; при этом необходимо отличать влияние этих агентов на кинетические параметры открывания-закрывания каналов от их влияния на проводимость одиночных каналов.

Дополнение 8.3. Определение константы связывания ингибитора по данным о проводимости единичного канала

Рассмотрим использование данных о проводимости единичного канала на примере исследования взаимодействия харибдотоксина с Са2 +-активируемым К +-специфичным каналом. Харибдоток-син, небольшой пептид, выделенный из скорпионов, является эффективным ингибитором этого канала. Биохимические характеристики канала не изучены, однако его работу интенсивно исследовали, используя технику регистрации тока через одиночные каналы. Для этого вначале готовили мембранные везикулы из поперечных волокон скелетных мышц крысы и проводили их слияние с плоским липидным бислоем. На рис. 8.5 приведены записи электрического тока через единичный канал, быстро переходящий из открытого состояния в закрытое. Если эти данные представить в милли-секундном масштабе, то можно будет увидеть отдельные акты срабатывания канала, как это показано на рис. 8.4.

При добавлении харибдотоксина в работе канала появляются длительные периоды, в течение которых он остается в непроводящем состоянии. Очевидно, связывание токсина каким-то образом блокирует канал. Частота появления этих «мертвых» периодов позволяет определить скорость связывания харибдотоксина с каналом; время, в течение которого каналы остаются закрытыми, зависит от константы скорости диссоциации комплекса канал--токсин.

Среднее время жизни канала в активном состоянии т\ обратно пропорционально скорости связывания токсина, а время жизни его в закрытом состоянии т - i -- скорости диссоциации:

Данные, представленные на рис. 8.5, показывают, что скорость блокирования канала зависит от концентрации токсина, а скорость диссоциации не зависит от концентрации свободного токсина.

Из этих данных легко получить как А:дисс, так и ксвяз для токсина; их отношение дает константу диссоциации. Замечательно, что получаемые параметры -- как кинетические, так и

термодинамические -- относятся к событиям, происходящим с индивидуальной молекулой.

НЕБОЛЬШИЕ МОЛЕКУЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЕЙ КАНАЛОВ И ПОР

Кинетические методы используются для анализа работы различных каналов и переносчиков, обнаруживаемых в биомембранах. Расшифрована аминокислотная последовательность многих из этих белков. Однако, до сих пор не удалось провести рентгенострук-турные исследования с высоким разрешением ни для одного из этих транспортных белков, поэтому при изучении структуры и механизмов работы каналов приходится прибегать к модельным построениям. Большие возможности дает использование малых молекул, способных образовывать поры в бислое. Особенно интересны в этом отношении три соединения: 1) нистатин -- полиеновый антибиотик, который образует комплекс с холестеролом; 2) грамидицин А -- пептид, который образует катионселективный канал, наиболее полно охарактеризованный из всех изученных к настоящему времени каналов; 3) аламетицин -- пептид, который образует регулируемый напряжением воротный канал.

Нистатин и амфотерицин В

Структурные формулы этих сходных полиенов приведены на рис. 8.6. Когда к содержащим стерол плоским мембранам с одной стороны от них добавляют нистатин, происходит увеличение мембранной проницаемости для воды, одновалентных ионов и небольших неэлектролитов. Неэлектролиты, ббльшие, чем глюкоза, пройти через канал не могут. Это говорит о том, что диаметр поры составляет около 8 А. На рис. 8.6 представлена модель канала, согласно которой от 8 до 10 молекул полнена образуют цилиндрическую структуру, в которой гидроксилированные сегменты каждой молекулы обращены внутрь, образуя заполненную водой пору. Наружная поверхность такой структуры неполярна, при этом между каждой парой молекул нистатина имеется пространство для молекулы стерола. Проводимость канала относительно низка, 5 пСм в 2 М КС1. Когда нистатин добавляют к плоской мембране с обеих сторон, две такие цилиндрические структуры, по-видимому, объединяются, образуя в два раза более длинный канал.

Необходимо отметить, что эта порообразующая молекула является амфифильной, поскольку обладает полярным и неполярным

участками. Полярная часть образуется из последовательно расположенных гидроксильных и карбонильных групп. Порообразующий комплекс, по-видимому, стабилен внутри бислоя. Обе эти структурные особенности характерны для большинства каналообразующих белков. Отметим, однако, что структура нистатиновой поры является гипотетической, хотя построена она на вполне разумных положениях и согласуется с экспериментальными данными.

Грамицидин А

Канал, образуемый грамицидином А -- гидрофобным пептидом из чередующихся L- и D-аминокислот, -- охарактеризован к настоящему времени наиболее полно. Исходя из имеющихся экспериментальных данных, была построена модель канала. Согласно модели, канал образован двумя молекулами грамицидина А, расположенными голова к голове в /3-спиральной конфигурации. В результате чередования L- и D-аминокислот образуется спираль, в которой все боковые цепи располагаются снаружи, а карбонильные группы остова -- внутри канала. Этот тип спирали не встречается больше ни в каких белках и образуется из-за необычного чередования стереоизомеров аминокислот в грамицидине А. С этой точки зрения грамицидин А является плохой структурной моделью формируемых белками трансмембраниых пор. Однако во многих других отношениях канал, образуемый грамицидином А, имеет много общих черт с другими каналами и порами. Отметим следующие его особенности.

Грамицидин А чрезвычайно гидрофобен, он не содержит ни одной полярной аминокислоты.

Проводимость единичного канала, образуемого грамицидином, довольно велика. Например, в 100 мМ RbCl катионная проводимость составляет 30 пСм на канал. Впрочем, это гораздо ниже теоретической предельной величины для поры этого размера, если перенос вещества через пору лимитируется только диффузией.

Грамицидиновый канал является катионселективным. Небольшие неорганические и органические катионы проходят через него, в то же время проницаемость по CI ~ равна нулю. Хотя этот анион достаточно мал, чтобы легко пройти через пору такого диаметра, он не транспортируется через грамицидиновый канал и не блокирует его. Этот факт весьма примечателен, если принять во внимание, что в грамицидине нет полярных или заряженных аминокислот. Такая селективность объясняется электростатическим отталкиванием анионов и диполей, образуемых карбонильными группами в воротах канала.

Проницаемость канала для одновалентных катионов изменяется в следующем порядке: Cs + > Rb + > К + > Na + > Li+; такая же последовательность сохраняется и для свободной диффузии этих ионов в воде. Селективность, проявляемая каналом в отношении данных одновалентных катионов, невелика, она соответствует всего пятикратному изменению коэффициентов проницаемости. Энергия активации проводимости мала, около 5 ккал/моль. В этом смысле канал функционирует так, как будто он заполнен водой. Возможности свободной диффузии катионов в растворе в значительной степени зависят от электростатических взаимодействий с водой. Небольшие ионы взаимодействуют с молекулами воды сильнее, чем крупные, и электростатическая поляризация вызывает замедление диффузии. Такого же рода силы, по всей вероятности, влияют и на лимитирующие стадии, когда катионы проходят через длинный узкий грамицидиновый канал.

Молекулы могут проходить через канал только поодиночке, поскольку его диаметр составляет всего 4 А. Следовательно, транспортируемый ион в момент вхождения в канал должен частично дегидратироваться. 'Помимо переносимого катиона в канале могут находиться от пяти до семи молекул воды, и ион будет контактировать с двумя из них, находящимися спереди и сзади от него. В канале должны присутствовать также группы, с которыми будет взаимодействовать транспортируемый ион вместо утраченных при дегидратации молекул воды. Дегидратация требует больших затрат энергии, поэтому скорее всего именно эта стадия будет лимитирующей.

Транспорт ионов через канал, образуемый грамицидином А, характеризуется при достаточно высоких концентрациях соли кинетикой с насыщением. Это указывает на то, что в канале имеется определенное число мест связывания катионов. Например, полунасыщающая концентрация для Na+-проводимости составляет 0,31 М. Кинетические модели переноса предполагают наличие двух мест связывания, по одному у каждого входа в канал. Связывание катиона осуществляется в результате его взаимодействия с диполями, в частности с карбонильной группой остатка 11.

Вода проходит через канал со скоростью около Ю8 молекул в 1 с при низкой ионной силе. Перемещение катиона под влиянием электрического поля сопровождается переносом 5--7 молекул воды, находящихся в канале, что создает электроосмотические эффекты.

Открывание и закрывание грамицидинового канала происходит соответственно в результате ассоциации мономеров, образующих димер, и диссоциации димера. Время жизни димера составляет порядка 10 мс--10 с и зависит от липидного состава мембраны и других факторов.

Когда грамицидин А находится в отрицательно заряженном липидном бислое, под влиянием поверхностных зарядов может произойти увеличение локальной концентрации катиона у входа в гра-мицидиновую пору. Это значительно увеличит проводимость канала при низких концентрациях соли.

Все сказанное выше ясно показывает, почему грамицидин А является столь важной экспериментальной моделью. Многие из его свойств аналогичны свойствам, проявляемым физиологически важными каналами, такими, как ацетилхолиновый рецептор.

Аламетицин

Аламетицин -- это один из представителей группы природных пептидов, которые образуют потенциалзависимые каналы и потому представляют собой хорошую модель для изучения регуляции работы канала с помощью трансмембранного потенциала. Молекула аламетицина состоит из 20 аминокислот, в частности, она содержит остатки а-аминоизобутирата. Основной структурной особенностью аламетицина и его гомологов является их способность образовывать а-спирали. В отличие от j3-cnnpa-ли, образуемой грамицидином А, пространство внутри а-спирали слишком мало, чтобы через него мог пройти ион. Экспериментальные данные скорее свидетельствуют о том, что до 12 молекул ала-метицина агрегируют и образуют пору. Когда аламетицин находится в такой конфигурации, полярные атомы оказываются внутри структуры. Отметим, что для обеспечения полярности наполненного водой канала не требуется присутствия боковых групп полярных аминокислот.

При низком напряжении плоская мембрана, содержащая аламетицин, не проводит электрический ток. По мере увеличения напряжения до некоего критического значения аламетициновые каналы начинают проводить ток. Напряжение на мембране может быть любого знака. Проводимость единичного канала очень высока: она составляет 5000 пСм в 1 М КС1 и свидетельствует о том, что размер пор очень велик. Если предположить, что канал образуется 12 агрегированными мономерами аламетицина, то его диаметр должен быть равен 20 А, что соответствует высокой проводимости единичного канала.

Для объяснения возможного механизма регуляции работы ала-метицинового канала путем изменения напряжения на мембране разработано несколько моделей. Все они предполагают, что диполи в а-спирали, образуемые пептидными группами, суммируются и создают общий диполь, такой, что положительный заряд локализуется на N-конце молекулы, а отрицательный -- на С-конце. Трансмембранный потенциал достаточно велик, чтобы при взаимодействии с этим постоянным диполем могло произойти изменение ориентации спирального пептида в мембране или увеличилась эффективность его включения в мембрану.

Рассмотрим простейшую модель, описывающую открывание канала при наложении поля. Согласно этой модели, под действием электрического поля увеличивается число встраиваемых в мембрану молекул аламетицина, в результате чего мономеры начинают агрегировать с образованием цилиндрического канала, причем процесс характеризуется высокой степенью кооперативности. Однако существует и другая точка зрения, согласно которой аламетицин находится в связанной с мембраной непроводящей форме уже в отсутствие напряжения и при наложении электрического поля только агрегирует с образованием канала в открытой конформации. Электрическое поле в рамках этих моделей вызывает дипольный флип-флоп-переход а-спирального пептида, стабилизируя агрегат, в котором а-спирали параллельны друг другу.

Аламетицин представляет собой хорошую модель, позволяющую объяснить процесс образования поры при ассоциации а-спира-лей; он также дает возможность продемонстрировать на простой системе, как трансмембранный потенциал стабилизирует определенные белковые конформации и тем самым оказывает существенное влияние на проводимость канала. Такими свойствами обладают не только пептиды типа аламетицина. В качестве примера можно привести синтетические пептиды и мелиттин.

Несколько примеров пор и каналов

В последнее время достигнуты большие успехи в определении строения пор и каналов на молекулярном уровне. Выявляются некоторые общие структурные элементы этих образований. Анализ аминокислотных последовательностей соответствующих молекул указывает на существование структурно родственных групп ионных каналов. Особенно ценным в этих исследованиях оказался метод реконструкции изображения; с его помощью удалось не только визуализовать отверстия в мембране, создаваемые большими порами, но и выявить симметричную организацию субъединиц вокруг центрального отверстия. Общим структурным мотивом для этих белков может быть цилиндрический канал, формируемый несколькими амфифильиыми а-спиралями разных субъединиц или отдельными доменами одной субъединицы. Впрочем, структура аламетицина и грамицидина А свидетельствует о том, что боковые цепи полярных аминокислот не нужны для формирования полярной внутренней структуры заполненного водой канала. Ни в одном из случаев не доказано достоверно, что кислые остатки непосредственно участвуют в образовании поры. Важным исключением из а-спирального семейства каналов являются пори-яы, поскольку они формируют поры из /3-слоев, а не с помощью а-спиралей.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5