Поры, каналы и переносчики

Поры, каналы и переносчики

Поры, каналы и переносчики

Фосфолипидный бислой является очень эффективным барьером для множества небольших растворимых молекул. Тем не менее, через плазматическую мембрану, а также через мембраны, ограничивающие различные органеллы, постоянно транспортируются полярные вещества и ионы. Этот транспорт целиком опосредован белками, и для объяснения механизма переноса растворимых веществ через мембрану было предложено много моделей.

Здесь будет полезно ввести несколько терминов, использующихся для характеристики белков или структур, участвующих в трансмембранном транспорте. В табл. 1 дается классификация транспортных белков. Прежде всего их подразделяют на каналы и переносчики. Поры и каналы часто изображают в виде туннелей через мембрану, в которых места связывания транспортируемых растворимых веществ доступны с обеих сторон мембраны одновременно. Канальные белки не претерпевают никаких конфор-мационных изменений в процессе переноса растворимых веществ с одной стороны мембраны на другую. Напротив, конформация переносчиков в процессе транспорта различных веществ изменяется.

Таблица 8.1. Классификация некоторых транспортных белков, основанная на механизме их действия и энергетике

1. Каналы

Потенциалзависимые каналы

Б. Химически регулируемые каналы

Другие каналы

11. Переносчики

А. Пассивные унипортеры Б. Активные переносчики

Первичные активные переносчики

а. Сопряженные с окислительно-восстановительными реакциями

б. Сопряженные с поглощением света

в. АТРазы

Вторичные активные переносчики

а. Симпортеры

б. Антипортеры

Переносимое вещество связывается с одной стороны мембраны, и для высвобождения его с другой стороны в переносчике должно произойти определенное конформационное изменение. При этом в любой момент времени место связывания вещества доступно только с одной стороны мембраны.

Каналы и поры также претерпевают конформационные изменения, однако последние регулируют лишь их открывание и закрывание и не касаются самого процесса переноса. Две основные группы каналов, приведенные в табл. 1, разделяются на каналы, работа которых регулируется изменением напряжения электрического поля или химическим путем. Каналы первого типа открываются или закрываются в ответ на изменение трансмембранного потенциала; наиболее изученными из них являются каналы электровозбудимых клеток, например нервных или мышечных. Каналы второго типа отвечают на действие специфических химических агентов; наиболее детально изученные из них -- каналы, связывающие нейро-медиаторы, например ацетилхолин. Так, никотиновый ацетилхоли-новый рецептор при связывании с ним нейромедиатора переходит в открытую конформацию и пропускает одновалентные катионы.

Термины пора и канал обычно взаимозаменяемы, однако под порой чаще понимают некие неселективные структуры, которые различают вещества главным образом по размеру и пропускают все достаточно малые молекулы. Под каналами чаще всего понимают ионные каналы, которые, как теперь известно, широко распространены во многих типах клеток, отличных от нервных и мышечных.

Переносчики можно разделить на две группы: пассивные и активные. Мы будем использовать термин пассивный переносчик в том случае, когда при его участии осуществляется перенос через мембрану единственного типа веществ. Переносчики-унипортеры только увеличивают поток вещества, идущий без потребления энергии, т. е. по градиенту электрохимического потенциала. Такой процесс называется облегченной диффузией. Наиболее полно изученным пассивным переносчиком является переносчик глюкозы в эритроцитах.

Активные переносчики осуществляют перенос веществ через мембрану с затратами энергии, в результате эти вещества накапливаются с одной стороны мембраны. При этом транспорт вещества должен быть сопряжен с другим, запасающим свободную энергию процессом. Почти все первичные активные переносчики являются ионными насосами, в которых перемещение иона прямо сопряжено с поставляющей энергию химической или фотохимической реакцией. Примером ионного насоса является бактериородопсин, который для переноса протонов через мембрану использует энергию фотонов видимого света. В большинстве случаев ионные насосы являются электрогенными: при работе первичного насоса осуществляется перемещение заряда, в результате чего происходит разделение электрических зарядов и на мембране создается напряжение.

Первичные активные переносчики генерируют напряжение и создают трансмембранные ионные градиенты. Вторичные активные переносчики используют такие градиенты в качестве движущей силы для транспорта растворимых веществ. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода является белок -- переносчик лактозы из Escherichia coli. Этот переносчик использует протонный электрохимический градиент, генерируемый дыхательной электронтранспортной цепью, в качестве движущей силы для накопления лактозы в клетке. Это пример симпорта, когда через мембрану одновременно переносятся два разных вещества. Антипортеры осуществляют транспорт веществ в противоположных направлениях. Так, например, белок полосы 3 эритроцитов осуществляет сопряженный транспорт CI ~ и НС03~ в противоположных направлениях через эритроцитарную мембрану.

Термины перемеаза, транслоказа и переносчик, являющиеся синонимами, часто используют по отношению к транспортным белкам, отличным от первичных активных переносчиков. Обычно термин «пермеаза» применяют при описании бактериальных транспортных белков. Термин «переносчик», по-видимому, лучше использовать по отношению к ионофорам или сходным с ними структурам, которые связываются с ионами и переносят их через бислой в составе комплекса.

Классификация транспортных белков, представленная в табл. 8.1, основана главным образом на энергетике и механизме транспорта растворимых веществ. Однако по мере установления аминокислотной последовательности все большего числа белков появляется возможность разработать другой принцип классификации транспортных белков -- на основе их структурного сходства. В табл. 8.2 показано несколько структурно родственных групп каналов и транспортных белков. При этом белки, входящие в состав одной группы, могут выполнять разные фукнции. В качестве примера рассмотрим переносчик глюкозы млекопитающих и переносчик Н +-арабинозы бактерий. Первый является унипортером, который может катализировать только облегченную диффузию глюкозы, в то время как второй способен сопрягать перенос ионов Н + по протонному электрохимическому градиенту с активным транспортом другого вещества, арабинозы. Ясно, что природа может приспособить одну и ту же структуру к выполнению различных функций.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ: РАЗНООБРАЗИЕ ФУНКЦИЙ

Функции ионных каналов и переносчиков весьма разнообразны; проиллюстрируем их на нескольких примерах. Так, регулируемые ионные каналы, участвующие в передаче сигнала, в ответ на определенный внешний стимул быстро изменяют мембранную проницаемость для определенного иона. При этом происходит изменение трансмембранного потенциала. К работе такого рода каналов предъявляется ряд требований. Во-первых, внешний сигнал должен вызывать быстрое переключение между открытым и закрытым состояниями канала. Необходимо также, чтобы быстро устанавливалось новое равновесие или стационарное значение мембранного потенциала. При этом очень существенна скорость процесса. Так, когда канал открыт, через бислой может проходить до 106--108 ионов в секунду. Такая величина потока является экспериментальным критерием, позволяющим отличить каналы от переносчиков. Столь большие ионные потоки означают, что открывание относительно малого числа каналов приводит к значительным быстрым изменениям электрических свойств мембраны. Рассмотрим на конкретном примере, как оценить время ответа мембраны на внешний сигнал.

Предположим, что мембрана с емкостью 1 мкФ/см2 содержит некоторое число К + -каналов с проводимостью в открытом состоянии 20 пСм. Проводимость, равная 1 пСм, эквивалентна 6-10* ион/с на 1 В, так что в нашем случае через каждый канал может пройти 1,2-108 ион/с на 1 В. Предположим, что на мембране существует К + -градиент с соотношением внутрн/снаружи = 52. Когда К +-каналы закрыты, мембранная проницаемость по К+ равна нулю и К* не участвует в образовании трансмембранного потенциала. При открывании каналов происходит перенос ионов К + по градиенту концентрации до тех пор, пока не установится новое стационарное распределение.

Таблица 8.3. Сравнение скоростей транспорта для некоторых систем"

В результате диффузии ионов К + через мембрану происходит разделение зарядов. При этом достигается равновесное значение трансмембранного потенциала, которое можно определить из уравнения Нернста. Легко подсчитать, что в нашем случае оно составляет 100 мВ. Заряд, необходимый для поддержания этого потенциала, определяется емкостью С, составляющей всего лишь ~ 10" 12 моль/см2. Столь незначительное число переносимых ионов, не вызывая заметных изменений в концентрации К* как по ту, так и по другую сторону мембраны, порождает тем не менее весьма значительный электрический сигнал.

Ключевой характеристикой канала является время, необходимое для достижения нового стационарного состояния после открывания канала. Оно зависит как от емкости, так и от удельного сопротивления мембраны. Если мы примем число открытых каналов равным 50 на 1 мкм2, то время ответа составит 0,1 мс.

В табл. 8.3 приведены значения числа оборотов для нескольких ионных каналов и переносчиков. Обратите внимание, что для ионных каналов и пор характерны очень большие числа оборотов. Напротив, для лактозопермеазы Е. coli максимальное число оборотов составляет всего лишь ~ 30 с ~1. Если бы рассмотренные выше ионные каналы работали с такой скоростью, то для достижения той же удельной проводимости потребовалось бы увеличить плотность каналов в 10 млн. раз, что физически невозможно.

Для осуществления лактозопермеазой ее физиологических функций, конечно, не требуется столь большого числа оборотов, как для каналов. Ее роль состоит в транспорте лактозы -- углевода, который затем участвует в клеточном метаболизме. Для ионных насосов, использующих для работы энергию гидролиза АТР или переноса электронов, характерны максимальные числа оборотов 102-- 103 с1, что довольно типично для ферментов, но гораздо меньше аналогичных значений для каналов или пор.

Однако не все переносчики работают столь медленно. Анионный переносчик белок полосы 3 из эритроцитарной мембраны играет важную физиологическую роль в усилении быстрого трансмембранного обмена С1" на НС03~. Одна из функций эритроцитов заключается в усилении транспорта СОг от различных тканей к легким. В венозных капиллярах СОг быстро диффундирует через эритроцитарную мембрану. В клетке под действием карбоангидразы СОг превращается в Н2СО3, затем быстро устанавливается равновесие Н2СО3 Н + + НС03~, и анион бикарбоната переносится через мембрану в плазму крови белком полосы 3. В результате по мере того, как эритроцит проходит по капиллярам, концентрация НС03~ в плазме увеличивается, причем этот процесс занимает меньше 1 с. Когда кровь достигает легких, начинается диффузия СОг в атмосферу. При этом под действием карбоангидразы в эритроцитах происходит массовое превращение Н2С03 в СОг и НгО. Этот процесс в свою очередь является движущей силой для переноса аниона бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СОг и НгО.

Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na +, вместе с НС03~был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НС03~ переносит в обратном направлении анион С1". Такая челночная система работает очень быстро, с числом оборотов 105 с1, что немногим меньше скорости переноса ионов настоящим каналом.

Дополнение 8.1. Время электрического ответа мембраны

Время электрического ответа т является мерой того, как быстро трансмембранный потенциал достигает нового равновесного значения после открывания специфических ионных каналов. В возбудимых мембранах этот параметр является ключевым и определяется емкостью

мембраны С и удельным сопротивлением R. Получим выражение для т.

Начнем с того, что продифференцируем по времени уравнение для емкости:

dQ/dt равно току / и равно нулю, когда напряжение достигает своего конечного значения Ук. Ток через ионный канал пропорционален разности между истинным напряжением и напряжением, определяемым из уравнения Нернста для равновесного состояния при нулевом потоке. В соответствии с законом Ома / = /R. Отсюда

Решение уравнения имеет вид

или где т = RC.

Напряжение на мембране растет экспоненциально от нуля до конечного значения 100 мВ с постоянной времени т, равной RC. Следовательно, произведение удельного сопротивления мембраны R на емкость С имеет размерность времени и характеризует время электрического ответа мембраны. Предположим, что в мембране открыто 50 каналов на 1 мкм2. Это значит, что удельная проводимость мембраны составляет 10 мСм/см2 и удельное сопротивление мембраны соответственно равно 100 Ом см2. В этом случае RC = 0,1 мс, что находится в интервале значений, характерных для возбудимых мембран зависит главным образом от удельного сопротивления мембраны, поскольку емкость определяется в основном липидным би-слоем.

Обратите внимание, что удельное сопротивление мембраны зависит от числа каналов, времени, в течение которого они открыты, и проводимости каждого канала в открытом состоянии. С разработкой методов, позволяющих реконструировать работу одиночных каналов, появилась возможность прямо измерить эти параметры.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ КАК ФЕРМЕНТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ СКОРОСТЕЙ

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных траспортных систем. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод-

ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что канал или переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения Утлх, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков и для многих каналов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы каналов

Применим теорию переходного состояния для анализа работы ионного канала в случае, когда ионы изначально присутствуют только с одной стороны мембраны. Примем» для простоты, что внутри канала имеется единственное место связывания и что ионы не могут свободно проникать внутрь канала или покидать его. Если внутри канала имеется много мест связывания, по которым ион может последовательно передаваться, то скорость переноса будет по-прежнему описываться уравнением Михаэлиса-- Ментен. Если принять, что трансмембранное напряжение равно нулю, то «реакцию» можно представить следующим образом:

где Е -- это канальный белок в «открытом» состоянии, Si и So -- транспортируемое вещество внутри и снаружи, ES -- комплекс субстрата с местом связывания внутри канала. На рис. 8.1 показан профиль свободной энергии для такой модели. Приведен также профиль для канала в закрытом состоянии. Прохождению иона через канал препятствует увеличение высоты одного из энергетических барьеров, но каков механизм этого процесса, пока неизвестно, за исключением, возможно, канала щелевого контакта. Закрывание канала может быть обусловлено, например, изменением положения а-спирали или только боковой цепи, в результате чего эффективно блокируется транспорт ионов через канал.

Применение критерия стационарного состояния дает уже знакомое уравнение Михаэлиса--Ментен для скорости:

„ к-, + k2 rc.

где Км = - , о -- суммарная концентрация переносчика.

Рассмотрим два случая: 1) насыщающая концентрация субстрата, > Км\ 2) низкая концентрация субстрата, < А"м.

1. Насыщающая концентрация субстрата. В этих условиях все места связывания заняты и скорость переноса достигает своего максимального значения, определяемого высотой энергетического барьера для выхода из канала. Это легко увидеть, преобразовав уравнение Михаэлиса -- Ментен для случая > Км:

2. Низкая концентрация субстрата. При < Км наблюдается линейная зависимость скорости от концентрации субстрата, т.е. имеет место кинетику второго порядка. Кажущуюся константу скорости второго порядка можно получить, преобразовав уравнение Михаэлиса--Ментен для случая малых:

Полученное уравнение достаточно важно, поскольку оно описывает работу большинства, если не всех ионных каналов. Кажущаяся константа скорости второго порядка для этой реакции равна к2/Км-Даже для столь простого случая это не истинная микроскопическая константа скорости, а комбинация констант скоростей.

Из этой простой модели следует несколько выводов.

1. Измеряемая константа скорости, которая определяет скорость транспорта по открытому ионному каналу, содержит информацию о кажущемся сродстве иона к месту связывания и о числе оборотов. В отсутствие напряжения на мембране эта константа скорости прямо связана с проницаемостью, обусловленной единичным каналом. Если внутренний барьер мал, то константа скорости транспорта будет равна ki -- константе скорости второго порядка для иона, входящего в канал. Лимитирующим фактором для этой реакции может служить диффузия, при этом к\ будет составлять 10--109M"'c_l. Если внутренний энергетический барьер велик, то константа скорости транспорта будет равна произведению -кг-

2. Зависимость скорости транспорта от напряжения определяется проводимостью. Это легко понять, если посмотреть, как падение напряжения на мембране влияет на индивидуальные микроскопические константы. Если на профиль потенциала, изображенный на рис. 8.1, наложить прямую, отвечающую линейному падению напряжения на мембране, то высота энергетических барьеров, отвечающих кг и к\, уменьшится, а к - i -- увеличится. В результате этого существенно увеличится константа скорости второго порядка для ионного транспорта, что и следовало ожидать. Простые модели типа рассмотренной нами не предсказывают линейной зависимости тока от напряжения, наблюдаемой экспериментально. Однако при введении в такие модели дополнительных энергетических барьеров кривая зависимости потока от напряжения становится очень близкой к линейной.

3. Ионную селективность можно объяснить несколькими путями. Селективность -- это способность канала пропускать некоторые ионы лучше, чем другие; ее можно количественно охарактеризовать как отношение проницаемостей или проводимостей для сравниваемых ионов. Поскольку в выражение для константы скорости транспорта входят как ки так и к2, то причиной селективной ионной проводимости может служить как более низкий энергетический барьер на входе в канал, так и более низкий барьер для перемещения внутри канала для определенного типа ионов. Например, если у входа в канал имеются отрицательные заряды или диполи, то скорость транспорта анионов может уменьшиться, т. е. канал окажется катионселективным. Такая картина наблюдается для нескольких рецепторных канальных белков и грамицидина А. Размеры переносимых веществ также влияют на скорость транспорта. Если размер молекулы переносимого вещества больше, чем диаметр канала, то это вещество не сможет попасть в канал. И наконец, селективность может быть связана с различием в скоростях переноса разных ионов внутри канала. Например, в случае Na+-селективного канала энергетический барьер для переноса этого иона внутри канала существенно ниже, чем для других ионов, таких, как К+, что ведет к увеличению проводимости no Na+. Представляется маловероятным, чтобы причиной ионной селективности было увеличение сродства иона к каналу. Такое изменение, соответствующее увеличению глубины впадины на профиле потенциала, должно было бы приводить к уменьшению скорости выхода иона из канала, т. е. к уменьшению максимального потока через канал, а также к уменьшению концентрации иона, необходимой для насыщения канала, т. е. к уменьшению Км. Около значения Км для тех каналов, которые преимущественно пропускают Na+ или К +, достаточно высоки, 200--300 мМ, что выше обычных физиологических концентраций этих ионов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков

Обратимся теперь к переносчикам. Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис. 8.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы. Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика: 1) белок обращен внутрь/связан с субстратом; 2) обращен внутрь/не связан; 3) обращен наружу/ связан с субстратом; 4) обращен наружу/не связан. Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий.

Субстрат связывается с участком, обращенным к одной стороне мембраны.

Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии. Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны.

Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к /иронс-стороне мембраны.

Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к j/ис-стороне.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5