Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4

При исследовании кометеболизма винилхлорида и этена у Pseudomonas aeruginosa strain DL1 было обнаружено, что при длительном культивировании (более 40 суток) неростовой субстрат винилхлорид становится ростовым [22].

1.4. Периодическое культивирование

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигает минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве) [24]. Кривая роста бактериальной культуры показана на рис. 1.5. Кривой роста называется кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени. Кривая роста позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности.

Лаг-фаза (начальная фаза). Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может быть связана с синтезом новых ферментов, которые ранее были не нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом. Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит диауксия.

Экспоненциальная фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость зависит от вида бактерий и от среды. Величина клеток у многих бактерий остается постоянной. Но нередко клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, температура), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата - при снижении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, скорость роста начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может уменьшаться также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления или накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.

Фаза отмирания и причина гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Число живых клеток может уменьшаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз) (рис. 5) [24].

1.5. Периодическое культивирование с подпиткой (fed batch culture)

Термин «периодическая культура с добавлением источников питания» ввели Иошида и др. для обозначения периодической культуры, в которую непрерывно добавляется питательная cреда [25].

Простое периодическое культивирование характеризуется ростом клеток без подачи дополнительных порций субстрата после посева культуры. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса. Для предотвращения негативных последствий лимита субстрата применяется техника культивирования с подпиткой, при этом субстрат или другие необходимые компоненты добавляются либо непрерывно, либо по сигналу от какого-либо датчика [26].

Периодическая культура с добавлением источников питания развивалась эмпирически для некоторых производственных ферментационных процессов, таких, как получение пенициллина, пекарских дрожжей и удаление отходов путем ферментации.

Для оптимизации выхода продуктов, выделяемых в среду, важно усилить биосинтетическую способность клеток бактерий, а метод культивирования с подпиткой позволяет продлить вторую фазу роста и повысить выход внеклеточных метаболитов. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта. При производстве пекарских дрожжей потребление кислорода регулируется скоростью добавления сахара.

Метод периодических культур с подпиткой использовали при культивировании рекомбинантного штамма Escherichia coli для получения аналога человеческого коллагена. Культура с подпиткой оказалась наиболее эффективным путём для достижения высокой плотности клеток и высокой продуктивности [27].

В периодическом режиме с подпиткой концентрированным субстратом исследовалась деструкция фенола при совершенствовании процесса обезвреживания токсичных стоков ксенобиотиков с использованием гибридной системы очистки с совмещением процесса химического и биологического окисления по месту и времени [28].

Периодическая культура с добавлением источников питания, кроме того, моделирует некоторые природные микробные системы, как, например, инфекцию мочевых путей. Теория такой культуры показывает, что она должна иметь важное и уникальное применение в управлении ферментационными процессами [25].

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Условия культивирования

Штамм LPM-4 стерильно пересевали на скошенные косяки ЭДТА-содержащего агара и выдерживали в термостате 5 суток. Для получения инокулята осуществляли смыв культуры с косяков, засевали в жидкую среду с ЭДТА и культивировали 3-4 суток. После чего инокулят в количестве 10 мл переносили в стерильные 750-мл колбы с 200 мл стерильной жидкой среды и культивировали в течение 10 суток на качалке при 150 - 200 об/мин при температуре 28є- 30єС.

Опыт включал два этапа. Эксперимент первого этапа состоял из 8 вариантов (рис. 6), а эксперимент второго этапа - из 10 вариантов (рис. 7).

Рис. 7. Схема эксперимента второго этапа опытов

2.2. Методика приготовления питательных сред

При культивировании штамма использовали среды с ЭДТА.

Твердая питательная среда используется для получения свежей культуры штамма.

Жидкую питательную среду применяли для получения посевного материала и для периодического культивирования. Твердую питательную среду готовили, как жидкую, с добавлением 3% агара.

Приготовление жидкой питательной среды

1) MgSO4*7 H20 10 мл/л

2) CaCl2*2 H2O 20 мл/л

3) KH2PO4 + NaH2PO4*12 H2O 10 мл/л

4) EDTA 10 мл/л

5) Микроэлементы 1 мл/л

(доводили до рН= 4,2) + 5,6 г/л ЭДТА:

FeCl2*4 H2O 1,5 г/л

H3BO3 0,06 г/л

MnCL2*6 H2O 0,1 г/л

CaCl2*6 H20 0,12 г/л

ZnCl2 0,07 г/л

NiCl2*6 H20 0,025 г/л

CuCl2*2 H2O 0,015г/л

Na2MoCl4 0,025 г/л

6) Витамины

Пиридоксин 20 мг

Тиамин 10 мг

Рибофлавин 10 мг

Никотиновая кислота 10 мг

Р - аминобензойная кислота 10 мг

Липоевая кислота 10 мг

Никотинамид 10 мг

Витамин В12 10 мг

Биотин 4 мг

Фолиевая кислота 4 мг

Растворяли все компоненты в 200 мл воды, стерилизовали при 0,5 атм. 30 минут и добавляли в жидкую питательную среду в количестве 1мл/л.

Компоненты питательных сред взвешивали на технических и аналитических электронных весах и растворяли в дистиллированной воде. Опыт по приготовлению питательных сред показал, что ее удобно готовить из заранее стерилизованных концентрированных растворов.

2.3. Методы анализа.

Пробы из колб отбирали один раз в сутки и проводили измерения рН, биомассы, концентрации глюкозы, ЭДТА и аммония.

Биомассу определяли спектрофотометрически на приборе Specol 221 (Germany) при 546 нм, после подкисления анализируемой пробы 5% раствором НNO3 до рН=2,0 для растворения солей, выпадающих в осадок в процессе культивирования. Содержание биомассы рассчитывали на основании оптической плотности клеточной суспензии используя раннее построенную калибровочную кривую.

Концентрацию ЭДТА определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе HPLC (Waters. Great Britan), оснащенном колонкой Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) при 285 нм. В качестве элюента использовали раствор, содержащий Fe(NO3)3* 9H2O 0,5 г/л, бромид тетрабутиламмония 0,4 г/л, HNO3 (65%) 0,8 мл, рН 2,1. Концентрацию ЭДТА рассчитывали, используя калибровочную кривую

Концентрацию глюкозы определяли энзиматически с использованием реактива Глюкоза ФС “ДДС” (“Диакон”). Принцип метода: глюкозооксидаза катализирует окисление в-D-глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярных количеств глюколактона и перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии фенола с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500 нм. Состав реагента: буферно-ферментный раствор, который содержащит калий фосфорнокислый -250 ммоль/л, фенол - 5 ммоль/л, 4-аминоантипирин - 0,5 ммоль/л, глюкозооксидазу - 10 000 Е/л, пероксидазу - 1000 Е/л. Пробы центрифугировали при 8 000 об/мин в течение 6 минут. Затем отбирали 20 мкл надосадочной жидкости и добавляли 2 мл реагента. Пробы перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем измеряли оптическую плотность при 500 нм. Содержание глюкозы определяли по калибровочному графику.

Содержание ионов аммония определяли потенциометрическим методом с помощью ионселективного электрода “Эком-NH4”. Метод анализа заключается в измерении величины равновесного потенциала ионселективного электрода, погруженного в раствор анализируемого иона. Потенциал измеряют относительно электрода сравнения, с помощью иономера Экотест - 120 (ИЭЛРАН НПП ЭКОНИКС). Погружали в раствор электрод “Эком-NH4” и электрод сравнения и измеряли значение равновесного потенциала.

2.3.1. Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4

Энергетический выход роста штамма LPM-4 вычисляли на основании теории материально-энергетического баланса роста микроорганизмов. Согласно этой теории доступными называются электроны, которые акцептируются свободным кислородом при окислении органического материала с образованием углекислого газа и воды. [29].

Содержание доступных электронов (ДЭ) в органических соединениях удобно выражать в расчёте на один атом углерода, то есть как степень восстановлености углерода (г).

Для соединения СНрОnNq величина степени восстановленности углерода вычисляется по формуле:

=4+p2n3q

Цифра 4 означает число ДЭ углеродного атома, к ней прибавляются ДЭ водорода, число которых равно числу p, приходящихся на один атом углерода. Из этой суммы вычитаются электроны энергетически обесцененные кислородом. Их число равно удвоенному числу атомов кислорода n , приходящихся на один атом углерода, так как у кислорода валентность равна 2. Из полученной разницы вычитается утроенное число атомов азота q , так как валентность азота равна 3, а энергетическое состояние электронов, связанных с азотом, не меняется в процессе роста.

Приведём уравнение количественной связи энергетического баланса с показателем материального баланса, как выход по субстрату Ys .

Энергетический выход (з) характеризует долю энергии субстрата, перешедшую в биомассу.

= в в/ s s Ys ,

где в восстановленность углерода в биомассе ;

s восстановленность углерода в субстрате ;

уs - доля (по массе) углерода в органическом субстрате;

ув - доля (по массе) углерода в биомассе;

в в/ s s отношение энергосодержания равных по весу количеств биомассы и субстрата;

в в = 2, для бактерий не синтезирующих липиды;

Ys выход клеток по массе, г/г;

Выход клеток по массе Y:

Yx/s = Х / S ,

где Х- концентрация биомассы, г/л;

S- количество потребленного субстрата, г/л.

Выход клеток по массе из ЭДТА (YЭДТА) рассчитывали как отношение биомассы, образованной из ЭДТА, к количеству потребленной ЭДТА. А выход клеток по массе из глюкозы рассчитывали как отношение биомассы, образованной из глюкозы, к количеству потребленной глюкозы.

Теоретический предел для энергетического выхода роста =1, так как в биомассе не может быть больше энергии, чем в использованном субстрате.

Расчет величины з для ЭДТА:

С10Н16О8N2

г= (4*10 +16- 2*8- 3*2) / 10= 3,4

М(ЭДТА)= 292

М(углерода) = 120

292 - 100%

120 - д

д = 0,410

гд= 3,4* 0,410= 1,4

= s (гbдb / г sдs) = s (2/1,4)

Расчет з для глюкозы:

С6Н12О6 СН2О

г= 4+2-2= 4

М(глюкоза) =180

М(углерода) = 72

180 - 100%

72 - д

д= 0,4

гд= 4* 0,4= 1,6

з = Хs (2/1,6)

2.3.2. Вычисление удельной скорости роста штамма LPM-4

Удельная скорость роста :

= (ln x2/x1)/(t2-t1) ,

где х2 - концентрация биомассы в конечный момент времени, мг/л;

x1 - концентрация биомассы в начальный момент времени, мг/л;

(t2-t1) - промежуток времени, в течение которого возросла биомасса, ч.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Известно, что бактериальный штамм LPM-4 характеризуется уникальной потребностью в ЭДТА для роста клеток и не растет на средах в отсутствие ЭДТА. Совместную ассимиляцию ЭДТА и глюкозы штаммом LPM-4 можно рассматривать как процесс кометаболизма, при котором ЭДТА является ростовым субстратом, а глюкоза косубстратом, ее метаболизм зависит от присутствия ЭДТА.

Опыт проводили в два этапа:

1) Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4;

2) Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата.

3.1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4

Бактерии выращивали на ЭДТА-содержащей среде с добавлением глюкозы в различные периоды культивирования: до посева или на 1, 2, 3, 4, 5, и 6 сутки роста клеток (рис. 6).

3.1.1 Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА бактериальным штаммом LPM-4

Данные об изменении плотности биомассы, рН, концентрации ЭДТА и аммония в различных вариантах сред представлены в таблицах 1-8.

Во всех вариантах опыта деградация ЭДТА отмечалась уже на 1 сутки роста и заканчивалась на 3 сутки, независимо от присутствия глюкозы в среде. Таким образом, можно сделать заключение, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывало влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА).

При внесении глюкозы в среду до посева бактерий (вариант 2) потребление глюкозы началось только на 3 сутки роста, после полной деградации ЭДТА, и закончилось на 8 сутки роста (приложение 2, рис. 3.1.1.1). Можно предположить, что энергия, образующаяся в процессе деградации ЭДТА, используется клетками для индукции ферментов метаболизма глюкозы или для ее транспорта. Потребление глюкозы сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем.

При внесении глюкозы в среду на 1 сутки роста бактерий (вариант 3) динамика ее ассимиляции была такой же, как в варианте 2. Потребление глюкозы началось после исчерпания ЭДТА из среды (3 сутки), закончилось на 8 сутки культивирования и привело к двукратному увеличению плотности биомассы (приложение 3, рис. 3.1.1.2).

Иная картина ассимиляции глюкозы наблюдалась при ее внесении в среду на 2 сутки роста бактерий, когда остаточная концентрация ЭДТА снизилась в 1,7 раза (вариант 4). Потребление глюкозы началось только на 4 сутки, затем наблюдалась длительная лаг фаза, когда концентрация глюкозы в среде не изменялась; интенсивная ассимиляция глюкозы происходила с 6 до 10 суток культивирования (приложение 4, рис. 3.1.1.3).

При внесении глюкозы в среду на 3 сутки роста клеток, когда деградация ЭДТА закончилась (вариант 5), глюкоза не потреблялась в течение 6 суток и только с 9 суток началась ее интенсивная ассимиляция (приложение 5, рис. 3.1.1.4). Таким образом, при внесении косубстрата в период, когда закончен метаболизм ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг фазы, вероятно, из-за недостатка энергии.

При внесении глюкозы в среду на 46 сутки культивирования (варианты 6, 7 и 8), т.е. через 1, 2 и 3 суток после полного потребления ЭДТА, не обнаружено ее ассимиляции (приложение 6-8, рис. 3.1.1.53.1.1.7).

3.1.2. Динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4

На рис. 3.1.2.1. представлена динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4 при культивировании на среде с ЭДТА. Как видно из рисунка, максимальная удельная скорость достигается на 2 сутки и составляет 0,042 ч-1.

В случае, когда добавляли глюкозу в среду до посева (рис. 3.1.2.2), максимальная удельная скорость была выше, чем в контроле, и составляла 0,057 ч-1 (2 сутки). При добавлении глюкозы в среду на 1 и 3 сутки роста бактерий (рис. 3.1.2.3.- 3.1.2.5.) наблюдалось два (а при добавлении глюкозы на 2 сутки - три) пика удельных скоростей. Первый пик характеризует рост за счет потребления ЭДТА. В варианте 3 (рис. 3.1.2.3.) он составляет 0,055ч-1 (2 сутки), в варианте 4 (рис. 3.1.2.4.) -0,049 ч-1, а в варианте 5 (рис. 3.1.2.5.) - 0,042 ч -1. Второй пик удельной скорости роста - за счет потребления глюкозы - был значительно ниже, чем за счет потребления ЭДТА. Максимальная удельная скорость роста за счет потребления глюкозы в третьем варианте составила 0,007 ч-1, в четвертом -0,006ч-1 и 0,016 ч-1, а в пятом -0,022 ч-1. Таким образом, добавление в среду глюкозы на 13 сутки приводит к повторному увеличению скорости роста бактерий, но в значительно меньшей степени, чем при начальной ассимиляции ЭДТА.

Наибольшее значение удельной скорости роста характерно для варианта, когда глюкоза добавлялась в среду до посева бактерий. Следовательно, время добавления косубстрата в среду значительно влияет на скорость роста бактерий.

3.1.3. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4

Анализируя рис. 3.1.3., можно сделать вывод, что концентрация аммония в среде увеличивается по мере деградации ЭДТА, поскольку ионы аммония - продукты деградации ЭДТА. Во всех вариантах концентрация аммония достигает максимального значения и остается на постоянном уровне в течение нескольких дней. Снижение концентрации аммония при длительном культивировании бактерий объясняется, по-видимому, тем, что клетки потребляют его .

При добавлении глюкозы снижение концентрации ионов аммония начинается раньше, чем в контроле. Интересен тот факт, что накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 на средах с добавлением глюкозы до посева и на 1 сутки роста бактерий происходит сходным образом, причем концентрация аммония в опытах значительно меньше таковой в контроле. Концентрация аммония в опыте на среде с добавлением глюкозы на 2 и 3 сутки роста также ниже контроля. Вероятно, это связано с тем, что аммоний используется для роста клеток в присутствии глюкозы.

3.1.4. Показатели роста штамма LPM-4 при кометаболизме ЭДТА и глюкозы

В таблице 3.1.4. представлены сравнительные результаты показателей роста штамма LPM-4 на различных вариантах сред. На средах с глюкозой суммарная биомасса включает биомассу, образованную как за счет потребления ЭДТА, так и за счет потребления глюкозы. Поскольку концентрация ЭДТА во всех вариантах сред была одинаковой (0,873 г/л), можно предположить, что количество биомассы, образованной из ЭДТА на средах с глюкозой, было таким же, как в контроле (0,196 г/л). Следовательно, если вычесть из суммарной биомассы количество биомассы, образованной из ЭДТА, мы получим количество биомассы, образованной из глюкозы.

Из таблицы видно, что наибольший выход клеток по массе из глюкозы достигается на среде с добавлением глюкозы на 3 сутки роста бактерий. Поскольку ЭДТА и глюкоза характеризуются различным энергосодержанием, правильнее сравнивать выход из этих субстратов не по массе, а по энергии. С этой целью рассчитывали энергетический выход клеток. Наибольший выход биомассы по энергии из глюкозы характерен для опыта на среде с добавлением глюкозы на 3 сутки роста бактерий.

Таким образом показано, что бактериальный штамм LPM-4, облигатный деструктор ЭДТА, не может использовать глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии, но способен метаболизировать ее в присутствии ЭДТА. Установлено, что ЭДТА индуцирует ассимиляцию глюкозы и является источником азота для роста клеток на глюкозе. Индукция ассимиляции неростового субстрата у штамма LPM-4 требует продолжительной лаг-фазы и сопряжена с деградацией ЭДТА. Явление совместного метаболизма ЭДТА и глюкозы можно назвать кометаболизмом.

Кометаболизм - трансформация неростового субстрата в присутствии ростового субстрата или иного метаболизируемого соединения. В данном

Таблица 3.1.4.

Показатели роста штамма LPM-4 при ассимиляции ЭДТА и глюкозы

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5