Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4

Не обнаружено ассимиляции глюкозы при ее внесении в среду через 13 сут после потребления ЭДТА.

3.2 Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата

В предыдущем разделе было показано, что ассимиляция глюкозы бактериальным штаммом LPM-4 индуцируется в процессе деградации ЭДТА, а кометаболизм ЭДТА и глюкозы у штамма LPM-4 не оказывает влияния на деградацию ЭДТА.

В данном разделе целью работы было исследование:

1) сохраняется ли способность клеток к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду;

2) сохраняется ли ЭДТА-индуцированная способность клеток ассимилировать глюкозу в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы;

3) сохраняется ли способность штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.

Схема эксперимента представлена на рисунке 2.1.2.

В первой серии опытов бактерии выращивали на среде с ЭДТА (вариант 1); затем дополнительно вносили ЭДТА на 4 сутки (вариант 2) и на 6 сутки (вариант 3) роста бактерий.

Во второй серии опытов бактерии выращивали на среде, содержащей ЭДТА и глюкозу (вариант 4) и дополнительно вносили глюкозу на 9 сут (вариант 6), 13 сут (вариант 8) и 21 сут (вариант 10).

В третьей серии опытов бактерии выращивали на среде с ЭДТА с подпиткой глюкозой; после потребления глюкозы вносили ЭДТА на 9 сут (вариант 5), 13 сут (вариант 7) и на 21 сут (вариант 9).

3.2.1. Исследование ассимиляции ЭДТА штамма LPM-4 в процессе культивирования с добавлением ЭДТА

Описание: Культуру выращивали на среде с ЭДТА (вариант 1 - контроль). Ассимиляция ЭДТА происходила достаточно быстро и закончилась на четвертые сутки роста (рис. 3.2.1.1, приложение 9), при этом наблюдался рост биомассы до 0,190 г/л. На четвертые сутки роста культуры добавили ЭДТА (вариант 2). При этом культура потребила ЭДТА очень быстро, на следующие сутки присутствовали лишь следы этого соединения, а прирост биомассы составил 0,244 г/л. На шестые сутки роста культуры, то есть через сутки после потребления ЭДТА, еще раз добавили ЭДТА (вариант 3). В данном случае потребление ЭДТА проходило медленно, и ассимиляция его закончилась только на 12 сутки роста; биомасса начала расти только на 10 сутки и достигла максимального значения 0,661 г/л на 12 сутки. После потребления ЭДТА наступила стационарная фаза и дальнейшего роста клеток уже не происходило. Прирост биомассы в варианте 3 составил 0,287 г/л, что гораздо выше, чем в предыдущих вариантах.

Задержка потребления ЭДТА и роста бактерий в варианте 3 возможно объясняется тем, что в течение 1-суточного голодания по ЭДТА произошло снижение активности фермента, ответственного за деградацию ЭДТА.

Согласно литературным данным, фермент первичной деградации ЭДТА (ЭДТА-монооксигеназа) является индуцебельным и его активность резко снижается в отсутствие ЭДТА [30].

Значения выхода клеток по массе и по энергии из ЭДТА были максимальны в контроле и составили 20,2% и 28,9% соответственно, а минимальны в варианте 3 и составили 17,1% и 24,4% соответственно (табл. 3.2.1.1). В вариантах 1 и 2 данные показатели мало отличались друг от друга.

Описание: культуру выращивали на среде, содержащей ЭДТА и глюкозу (вариант 4 - контроль). Потребление глюкозы в контроле началось только после потребления ЭДТА, т.е. на четвертые сутки, и закончилось на девятые сутки (рис. 3.2.2.1, приложение 10). При этом наблюдалось увеличение биомассы от 0,075 г/л до 0,507 г/л. Затем после потребления глюкозы в среду дополнительно внесли глюкозу (вариант 6). Ее ассимиляция началась сразу же и закончилась уже на 13 сутки роста культуры, при этом биомасса продолжала интенсивно расти, и прирост биомассы составил 0,295 г/л. На 13 сутки после потребления глюкозы еще добавили глюкозу (вариант 8).

На этот раз ее ассимиляция началась сразу же, как и в предыдущем варианте, но продолжалась дольше и практически закончилась на 22 сутки роста культуры.

Таблица 3.2.2.1.

Показатели роста штамма LPM-4 при многократном внесении глюкозы в среду

Выход клеток по массе и по энергии из глюкозы были максимальны в четвертом и шестом варианте и составили 16,5% и 20,6%; 17,5% и 21,9% соответственно, а минимальны в 10 варианте и составили 3,7% и 4,6% соответственно (табл. 3.2.2.1).

Таким образом, мы убедились еще раз, что ассимиляция глюкозы начинается только после полного потребления ЭДТА и приводит к увеличению биомассы. Кроме того, штамм LPM-4 сохраняет способность ассимилировать глюкозу при многократном ее введении. Несколько сниженная ассимиляция глюкозы в варианте 8 и очень медленная ее ассимиляция в варианте 10, по сравнению с контролем (вариант 4), а также незначительный прирост биомассы в этих вариантах объясняется тем, что в среде ужу отсутствуют питательные компоненты: азот, макроэлементы (такие, как фосфор, калий, сера), микроэлементы и витамины, необходимые для роста клеток. Низкие показатели выхода клеток по энергии в 8 и 10 вариантах говорят о том, что хоть глюкоза и потребляется, но синтеза биомассы не происходит.

3.2.3. Исследование способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА

Описание: культуру выращивали на среде, содержащей ЭДТА и глюкозу (вариант 4 - контроль), а после исчерпания глюкозы на девятые сутки роста добавляли ЭДТА (вариант 5). ЭДТА очень быстро потребился и уже на 11 сутки роста культуры ЭДТА в среде не был обнаружен (рис. 3.2.3.1, приложение 11). Биомасса значительно увеличилась и прирост ее на этот период составил 0,325 г/л, после чего наступила стационарная фаза.

Выход клеток по массе и по энергии из ЭДТА в контроле составили 22,8% и 32,6% соответственно, а в опыте 16,9% и 24,1% соответственно (табл. 3.2.3.1).

На 13 сутки к культуре, выращенной на глюкозе, добавили ЭДТА (вариант 7). Потребление ЭДТА происходило быстро и закончилось на 15 сутки роста (рис. 3.2.3.2, приложение 12). Прирост биомассы был небольшим, и составил за этот период 0.146 г/л.

Выход клеток по массе из ЭДТА в варианте 7 составил 9,2%, а по энергии 13,1% (табл.3.2.3.2).

При добавлении ЭДТА к 13-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы (вариант 9), потребление ЭДТА произошло быстро и закончилось на следующие сутки (рис. 3.2.3.3 и приложение 13), однако прирост биомассы был незначителен. Выход клеток по массе из ЭДТА составил 6,6%, а выход клеток по энергии - 9,4% (табл. 3.2.3.3).

В итоге можно сделать следующее заключение. Во-первых, культура сохраняет способность к ассимиляции ЭДТА, добавленного на разные сутки роста штамма LPM-4 в присутствии глюкозы. Следовательно, клетки сохраняют способность к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА даже после длительного потребления глюкозы.

Во-вторых, значения выхода клеток по массе и по энергии из ЭДТА с увеличением времени роста культуры уменьшаются, что, по-видимому, связано с истощением питательных компонентов среды. В-третьих, выход клеток по массе и энергии из ЭДТА и выход клеток по массе и энергии из глюкозы мало отличаются друг от друга.

Таблица 3.2.3.1.

Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 9 суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы

Таблица 3.2.3.3.

Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 21-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы

Таким образом, полученные результаты показывают, что штамм LPM-4 сохраняет способность к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду, что приводит к увеличению биомассы. Также доказано, что ЭДТА-индуцированная способность штамма LPM-4 к ассимиляции неростового субстрата глюкозы является стабильной и сохраняется в течение длительного культивирования с подпиткой глюкозой. Снижение прироста биомассы с увеличением времени культивирования объясняется, по-видимому, истощением питательной среды. Показано, что неростовой субстрат, то есть глюкоза, в процессе длительного культивирования становится ростовым субстратом. Установлена способность бактерий к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывает влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА) штаммом LPM-4.

При внесении глюкозы в среду до посева ее потребление началось после завершения деградации ЭДТА и сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем. При внесении косубстрата в момент исчерпания ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг фазы, вероятно, из-за недостатка энергии. Не обнаружено ассимиляции глюкозы при ее внесении в среду через 1-3 суток после потребления ЭДТА.

Величины выхода клеток по массе из ЭДТА и глюкозы (при внесении глюкозы до посева или на 1-3 сутки) мало различались и составили 22,4% и 19,9-21,4% соответственно. Однако, поскольку ЭДТА и глюкоза характеризуются различным энергосодержанием, более правильно сравнивать энергетический выход клеток из этих субстратов. Энергетический выход характеризует долю энергии субстрата, перешедшую в биомассу. Поскольку энергосодержание глюкозы выше, чем ЭДТА (значения составляют 1,6 и 1,4 соответственно), выход биомассы по энергии из ЭДТА был выше, чем из глюкозы и составлял 32%, тогда как выход клеток по энергии из глюкозы изменялся в пределах от 24,9 до 26,8 %.

Анализируя результаты второго этапа опытов, мы убедились, что культура сохраняет способность ассимилировать ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду. Повторное добавление ЭДТА в среду приводит к увеличению биомассы, то есть запаса питательных компонентов среды достаточно для поддержания роста клеток.

Показано, что штамм LPM-4 сохраняет ЭДТА-индуцированную способность ассимилировать глюкозу при многократном ее введении. Несколько сниженная ассимиляция глюкозы по сравнению с контролем и незначительный прирост биомассы при длительном культивировании бактерий (в течение 1321 суток) объясняется тем, что в среде уже отсутствуют компоненты питательной среды, необходимые для роста культуры. Низкие показатели выхода клеток по массе и энергии при длительном культивировании говорят о том, что хоть глюкоза и потребляется, но синтеза биомассы не происходит.

Показано, что клетки штамма LPM-4 сохраняют способность к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования.

Результаты данного исследования важны для дальнейшей разработки нового биопрепарата по очистке сточных вод, который будет включать ЭДТА-разрушающий штамм LPM-4. Полученные данные помогут в выборе условий, оптимальных для деятельности штамма. Но нужно провести еще много работы, чтобы получить этот биопрепарат.

Выводы

1. Установлено, что кометаболизм ЭДТА и глюкозы у штамма LPM-4 не оказывает влияния на деградацию ЭДТА.

2. Показано, что ассимиляция глюкозы бактериальным штаммом

3. LPM-4 индуцируется только в процессе интенсивной деградации ЭДТА.

4. Обнаружено, что штамм LPM-4 сохраняет способность к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду.

5. Доказано, что бактерии сохраняют способность к ЭДТА-индуцированной ассимиляции глюкозы в процессе длительного культивирования с многократным добавлением глюкозы.

6. Установлено, что штамм LPM-4 способен к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.

Литература

2. Босоло Ф. Химия координационных соединений.- М.: Мир, 1966.-145с.

3. Kari F.G. Modeling the photochemical degradation of ethylenediaminetetraacetate in the river Glatt/ F.G. Kari, W. Giger// Environ.Ski Technol.- 1995.-V.29.-P.2814-2827.

4. Bucheli-Witschel M., T. Egli Environmental fate and microbial degradation of aminopolycarboxylic acids // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - V.25. - P.69 - 106

5. Gschwind N. Biologischer Abbau von EDTA in einem Modelwasser // Wasser Abwasser. - 1992. - V.133. - P.546 - 549.

6. Chistyakova T.I., Dedyukhina E.G., Satroutdinov A.D., Kaparullina E.N.,

Gavrish E.Yu., Eroshin V.K. EDTA- dependent bacterial strain.//Process Biochem. 2005. V. 40. N 2. P. 601-605.

7. Бек М. Химия равновесий реакций комплексообразования. - М.: Мир, 1973. 145с.

8. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран. - М.: Наука, 1983. - 120 с.

9. Ляхович В.В. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. - Новосибирск.: Наука, 1978. - 47 с.

10. Witschel M., Nagel S., Egli T. Identification and characterization of the two-enzyme system catalyzing the oxidation of EDTA in the EDTA-degrading bacterial strain DSM-9103 // J.Bacteriol. - 1997. - V.179. - P.6937 - 6943.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5