Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе

Таким образом если ЭБС в исследуемых отделах мозга практически не вызывал изменения активности АПФ, то введение лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС вызывает некоторые изменения в активности АПФ в этих отделах, особенно ярко эта тенденция прослеживается в гипофизе через 24 часа, а также в стриатуме через 4 часа. Стойкая динамика увеличения активности АПФ показана также в семенниках.

Сравнение активности АПФ после введения лей-энк-арг стрессированным животным с введением этого пропептида интактным крысам показывает, что более выраженное влияние на активность фермента предшественник лей-энкефалина оказывает при введении его животным, не подвергающимся стресс-воздействию.

Таким образом, введение лей-энкефалин-арг перед началом острого ЭБС вызывает повышение активности КПН по сравнению с соответствующими показателями активности стрессированных и интактных животных в стриатуме - отделе мозга, связанном преиму-щественно с синтезом регуляторных пептидов стресспротективного действия. Предварительное введение предшественника лей-энкефалина предотвращало повышение активности КПН в гипофизе - отделе, где синтезируются стресс-пептиды.

Введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Особенно ярко такая тенденция прослеживается в тех отделах мозга и тканях, где осуществляется синтез биологически активных пептидов, проявляющих выраженную антистрессорную активность. Активность ФМСФ-ингибируемой КП при этом была близка к норме.

Аргинизированный лей-энкефалин влиял на активность АПФ головного мозга, надпочечников и семенников стрессированных животных в гораздо меньшей степени, чем на активность КПН и ФМСФ-ингибируемой КП. Наибольшее влияние пептида обнаружено в семенниках.

Обнаружено, что введение лей-энкефалин-арг интактным и стрессированным животным вызывает различные по степени выражен-ности и направленности изменения активности изучаемых ферментов. Наиболее значительные изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ обнаружены у животных, не подвергавшихся воздействию стресса.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем биохимии, физиологии и медицины является изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Особую значимость при этом приобретает изучение острого стресс-воздействия на организм, поскольку именно кратковременное импульсное стрессирование приводит к экстренному повышению адаптивных способностей. Менее всего изучено влияние острого эмоционально-болевого стресса (ЭБС). Важную роль в устранении и/или ограничении стрессорных нарушений играет система эндогенных опиоидов [8, 14, 102, 106, 135, 236, 242]. Синтез природных опиоидных пептидов и их синтетических аналогов открыл перспективы для их использования при разного рода стресс-повреждениях организма [123]. Было показано, что выраженным антистрессорным действием обладают лей- и мет-энкефалины, лей-энкефалин-арг, синтетический аналог лей-энкефалина - даларгин [69, 105]. Несмотря на короткую продолжительность жизни экзогенных опиоидных пептидов в организме, проявляемые ими эффекты сохраняются на протяжении достаточно длительных промежутков времени [10, 11, 13, 119]. Одним из малоизученных вопросов в понимании механизмов длительного последействия экзогенных опиоидных пептидов является выяснение путей образования и инактивации других регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на введение опиоидов. Поскольку известно, что уровень большинства биологически активных пептидов и, следовательно, степень реализации адаптационных реакций при стресс-повреждениях организма, в значительной степени определяется активностью пептидгидролаз, то особый интерес вызывает изучение механизмов регуляции активности ферментов обмена нейропептидов при стресс-воздействии.

Исходя из вышеизложенного, интересным представляется изучение влияния экзогенного предшественника лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6 на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в норме и при воздействии острого ЭБС.

Поскольку КПН и АПФ участвуют в формировании стрессовой реакции организма, а дополнительное экзогенное введение жидкости влечет за собой возникновение стресса, то введение пропептида осуществлялось способом, который согласно данным [1, 24, 119] менее всего травмирует животное, обеспечивает более полное проникновение экзогенного вещества в мозг и позволяет использовать меньшие концентрации веществ - инстилляцией на конъюнктиву глаза.

Существенную роль в проявлении специфической активности изучаемых ферментов по отношению к регуляторным пептидам играют особенности их тканевой локализации. В связи с этим, представляется необходимым более детальное изучение регионального и тканевого распределения активности КПН, ФМСФ - ингибируемой КП и АПФ.

Максимальная активность КПН у интактных животных показана в гипофизе - отделе, где синтезируются стресс-пептиды и многие нейропептиды стресс-протективного действия (табл.1). Высокий уровень активности фермента обнаружен также в гипоталамусе, четверохолмии, стриатуме - отделах лимбической системы, богатых опиоидными и другими нейропептидами [156, 168, 169, 221, 247]. Надпочечники и семенники характеризуются низкими показателями активности КПН. Полученные данные о региональном и тканевом распределении активности КПН, хорошо согласуются с литературными [37, 187, 248]. Таким образом, полученные нами сведения о высоком уровне активности этого фермента в отделах мозга и тканях, связанных с образованием и секрецией многих регуляторных пептидов [235] подтверждают участие КПН в процессинге нейропептидов в этих регионах.

Биологическая роль ФМСФ-ингибируемой КП в организме к настоящему моменту остается неясной. Сведения о тканевом и региональном распределении ФМСФ-ингибируемой КП носят фрагментарный характер. У исследованных нами групп животных высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в надпочечниках и гипофизе (табл.1). Регионы мозга характеризуются более низкими показателями, при этом активность ФМСФ-ингибируемой КП распределена достаточно равномерно. Полученные нами данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП согласуются с уровнем нейропептидов в этих структурах, что подтверждает ранее выдвигаемые предположения [49, 53, 119, 149]о вовлечении этого фермента в обмен регуляторных пептидов. Однако более конкретное определение роли этого фермента в обменных процессах остается на данном этапе открытым вопросом. В связи с вышесказанным, представляется необходимым более детальное изучение некоторых характеристик этого фермента: сравнение уровня его активности с активностью КПН - фермента, биологическая роль которого определена, а также исследование распределения активности ФМСФ-ингибируемой КП в отделах мозга и органах при различных функциональных и патологических состояниях организма.

Интересно отметить, что в гипофизе - отделе, в котором синтези-руются многие нейропептиды и гормоны пептидной природы [232], активность КПН существенно не отличается от таковой для ФМСФ-ингибируемой КП, в то время как в надпочечниках - отделе, где синтезируются преимущественно энкефалины [33, 34], активность ФМСФ-ингибируемой КП существенно выше активности КПН. Как показывают данные некоторых исследований, пептидные гормоны, синтезирующиеся в гипофизе, содержат в неактивной форме перед остатком основной аминокислоты остатки аминокислот - аланина и глицина [62]. Образующиеся в надпочечниках энкефалины содержат в качестве предпоследних остатки гидрофобных аминокислот (лейцина и метионина) [62]. Принимая во внимание, также, особенности регионального распределения КПН и ФМСФ-ингибируемой КП можно высказать предположение об участии этих ферментов в процессинге предшественников нейропептидов, различных по своему качественному составу. Возможно, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в процессинге проформ, содержащих в качестве предшествующей основным аминокислотам - аргинину и лизину, гидрофобной аминокислоты. Что же касается КПН, то она, вероятно, участвует в процессах модификации проформы с предшествующей аминокислотой, содержащей короткий алифатический радикал (аланин и глицин).

Достаточно высокий уровень активности ФМСФ-ингибируемой КП, по сравнению с КПН, обнаружен в семенниках. Поскольку известно, что семенники, наряду с образованием некоторых регуляторных пептидов, характеризуются и достаточно высоким уровнем катаболизма белков, а свойства ФМСФ-ингибируемой КП во многом схожи с таковыми у лизосомальной КПА (Кф 3.4.16.1), которая вовлекается в интенсивный катаболизм белка, то показанная высокая активность ФМСФ-ингиби-руемой КП может являться свидетельством вовлечения ее в процессы инактивации регуляторных пептидов в периферических тканях. В связи с этим, можно выдвинуть предположение о существовании различных форм фермента, по-разному проявляющих свою активность в мозге и периферических тканях.

Распределение активности АПФ хорошо изучено во внемозговых образованиях, что же касается исследования активности этого фермента в различных регионах мозга, то данному вопросу, до недавнего времени уделялось недостаточное внимание. Известно, что АПФ участвует в процессинге ангиотензина , инактивации брадикинина, в последова-тельном гидролизе энкефалиновой молекулы [66, 180, 182, 196, 209, 234].

Изучение активности АПФ у интактной группы животных показало, что наибольшая активность фермента обнаруживается в гипофизе и семенниках (табл.1), где синтезируются многие биологически активные пептиды. Достаточно высокие показатели активности отмечены, также, в стриатуме - отделе, характеризующимся высоким содержанием нейропептидов [62, 221]. Данные ряда исследований свидетельствуют о том, что закономерности, описывающие роль периферической ренин-ангиотензиновой системы не могут быть перенесены на системы центральной регуляции, ввиду существования определенной автономии и биохимической специфичности АПФ в мозге и на периферии [66, 196, 222]. В связи с этим, присутствие высокой активности АПФ как в отделах мозга, так и в семенниках может быть признано как свидетельство участия этого фермента в обмене различных по своему функциональному составу нейропептидов, содержащихся в мозге и периферических тканях. Не исключена также возможность участия АПФ в обмене нейропептидов, одинаковых по своему функциональному составу, хотя этот процесс, вероятно, по-разному протекает в мозге и тканях, что может свидетельствовать в пользу существования изофермента [66].

Таким образом, полученные нами сведения о региональном и органном распределении АПФ хорошо согласуются с литературными данными по локализации нейропептидов в структурах мозга и тканях [156, 196, 221], что подтверждает участие АПФ в обмене регуляторных пептидов [182, 183].

Основой для более детального представления о биологической роли изучаемых ферментов в мозге и периферических тканях могут послужить исследования по изучению их активности при экстремальных воздействиях.

Известно, что при воздействии стресс-факторов осуществляется мобилизация важнейших физиологических систем организма, направленная на поддержание его гомеостаза и адаптации к неблагоприятным условиям среды [144]. Развитие адаптационных реакций является следствием активации стресс-лимитирующих систем, таких как ГАМК-эргическая, серотонинэргическая, энкефалинэргическая [5, 116], что в первую очередь выражается в усилении синтеза их основных компонентов. Известно, что одним из видов воздействия, приводящим к генерализованной мобилизации стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем организма является острый ЭБС [37, 70, 121, 141, 145, 155]. Однако многие аспекты возникновения и развития стресс-реакции при воздействии ЭБС изучены недостаточно. Менее всего исследованы ферментативные механизмы, обеспечивающие функцио-нирование физиологических систем при остром ЭБС.

Изучение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у крыс при воздействии острого ЭБС показало изменение их активности в изучаемых отделах мозга и периферических тканях (табл. 2, рис.1-3).

Наиболее выраженное повышение активности КПН при остром ЭБС отмечено в гипофизе. Активность фермента была выше показателей интактных животных (табл.2, рис.1), что согласуется с изменениями его активности при других видах стресса [42, 64]. Повышение активности КПН в ранний период после стресса в гипофизе - отделе, где синтези-руются стресс-пептиды [142, 232, 243], по-видимому, связано с увеличением их синтеза и секреции. Поскольку известно, что КПН in vivo вовлекается в образование АКТГ [189], являющегося важным компонентом стресс-реализующих систем, то повышение активности КПН через 0,5 и 4 часа после воздействия является специфичным ответом организма на стресс и способствует увеличению размаха стресс-реакции в организме. Достаточно длительное повышение активности КПН отражает длительный характер ответной реакции организма на воздействие стресс-фактора. Известно, что после однократного ЭБС вслед за катаболической стадией, развивается более длительная - анаболическая, которая характе-ризуется генерализованной активацией синтеза различных физиологически активных веществ, способствующих адаптации организма к стрессовой ситуации [121, 122]. Поскольку гипофиз обладает повышенным содержанием энкефалинов [221], вещества Р [241], то, вероятно, повышение в нем активности КПН через 24 и 72 часа связано с участием фермента в процессинге этих регуляторных пептидов. Необходимость в дополнительном синтезе пептидов стресс-протективного действия обусловлена интенсивной секрецией их в начальном периоде развития стресс-реакции и, следовательно, истощением их запаса. Таким образом, полученные результаты согласуются с литературными данными об участии КПН не только в развитии стресса, но и в ограничении интенсивности стресс-реакции [37, 142, 232, 243].

Установлено, что при воздействии стресса в мозге увеличивается содержание опиоидов, вещества Р, и др. [35, 138, 139, 236]. Обнаруженное на поздней стадии развития стресса повышение активности КПН в стриатуме и больших полушариях свидетельствует о вовлечении фермента в процессинг этих биологически активных пептидов, что приводит к увеличению их содержания в названных структурах мозга при остром ЭБС и способствует угасанию стресс-реакции.

Содержание стресс-протективных пептидов - энкефалинов, вещества Р - в среднем мозге и гиппокампе при стрессе также увеличивается [56]. Однако в этих структурах мозга через 4 часа после воздействия активность фермента была ниже показателей интактной группы. Сходная тенденция к снижению активности КПН отмечена и в надпочечниках. Известно, что КПН локализована преимущественно в везикулах секреторных клеток [195]. В результате их опустошения после воздействия стресса высвобождаются как пептиды, так и локализованные в них молекулы КПН. Следовательно, обнаруженное снижение активности КПН может быть обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента в секреторных везикулах.

Таким образом, показанное после острого воздействия ЭБС, изменение активности КПН в отделах мозга, гипофизе и надпочечниках вызвано изменениями в метаболических процессах, которые связаны, прежде всего, с мобилизацией стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем.

В отличие от КПН, выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех отделах мозга и надпочечниках наблюдалось через 72 часа после воздействия (табл.2, рис.2). Наиболее существенные изменения отмечены в больших полушариях и надпочечниках.

Известно, что при остром ЭБС обнаруживается значительное увеличение активности лизосомальных ферментов, которые вовлекаются в деградацию избытка нейропептидов, синтезированных в ответ на стресс [121]. При этом отмечено, что активность лизосомальных ферментов остается повышенной даже через 5 суток после завершения стресс-воздействия [121]. Поскольку ФМСФ-ингибируемая КП, предположительно, является изоферментом лизосомальной КПА [53], то увеличение активности фермента через 72 часа после острого ЭБС может являться свидетельством участия ФМСФ-ингибируемой КП в деградации избытка регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на стресс. Повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках - органе, содержание энкефалинов в котором при воздействии стресса увеличивается [34] и больших полушариях, характеризующихся высоким уровнем катаболизма [17, 22], подтверждает выдвинутое предположение.

В отличие от ФМСФ-ингибируемой КП, активность которой существенно повышалась в надпочечниках, наиболее выраженные изменения активности КПН наблюдались в гипофизе. Поскольку известно, что в надпочечниках синтезируются преимущественно энкефалины, а в гипофизе - гормоны пептидной природы, то полученные данные могут свидетельствовать об участии этих ферментов в обмене разных биологически активных пептидов.

Сходная с КПН тенденция к повышению активности ФМСФ-ингибируемой КП в ранние периоды после стресса отмечена в семенниках, где активность фермента была выше нормы только через 0,5 часа. Не исключено, что в семенниках данный фермент может вовлекаться и в процессинг регуляторных пептидов при стрессе.

Таким образом, в ответ на воздействие острого ЭБС вовлекается как КПН, так и ФМСФ-ингибируемая КП. Различная динамика изменений активности этих ферментов в мозге и периферических тканях позволяет выдвинуть предположение о включении этих ферментов на разных этапах обмена нейропептидов. При этом, обе КП участвуют в обмене регуляторных пептидов в тех отделах мозга и органах, которые предохраняют стресс-систему организма от истощения.

Одним из важных звеньев в механизмах функционального взаимодейтсвия энкефалинэргической, ренин-ангиотензиновой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) является АПФ [209]. В связи с этим, исследование активности АПФ после воздействия острого ЭБС рассматривается как значимое звено в цепи изучаемых реакций организма, так как изменения в активности АПФ в отделах мозга и периферических тканях могут отражать региональную функцию ангиотензин-образующей системы в условиях стресса.

Полученные нами данные показали снижение активности АПФ в стриатуме и гипофизе через 4 часа после воздействия ЭБС (табл.2, рис.3). При воздействии стресса наблюдается нарушение проницаемости мембран и повышение содержания ионов Na+, что может вызвать торможение синтеза АПФ [64], чем, вероятно, и объясняется наблюдаемое снижение активности АПФ.

До настоящего времени функциональная роль АПФ в половых органах млекопитающих остается не до конца изученной. Известно, что функции семенников модулируются опиоидными пептидами [197], образование которых при воздействии острого ЭБС увеличивается. Структура энкефалинов такова, что АПФ может расщеплять их до ди- и три-пептидов [180]. В связи с этим, повышение активности АПФ в семенниках через 0,5 часа после острого ЭБС может быть охарактеризовано как ответная реакция организма на повышение уровня опиоидных пептидов, что направлено на стабилизацию вызванного стрессом повышенного баланса опиоидных пептидов. Возможно, что снижение активности АПФ в семенниках в последующие промежутки времени является следствием замедления процесса инактивации синтезированных в ответ на стресс-воздействие нейропептидов.

Таким образом, обнаруженные при воздействии острого ЭБС изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ являются, вероятно, следствием их участия в процессах синтеза и/или деградации компонентов стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем.

Наблюдаемое после стресс-воздействия увеличение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов, приводит не только к развитию адаптационных реакций, но и к истощению нейрогуморальных систем [4, 145]. Интенсивное исследование системы эндогенных опиоидных пептидов показало их участие в механизмах физиолого-биохимической регуляции процессов, возникающих при стресс-повреждении организма [100, 101, 102, 125, 134]. Особое практическое значение, в связи с этим, имеет использование опиоидных пептидов и их синтетических аналогов в качестве агентов, компенсирующих изменения в метаболизме мозга и органов животных при стрессе. Повышенное стресс-протективное свойство аргининсодержащего гексапептидного аналога лей-энкефалина - даларгина объясняется, прежде всего, наличием в его молекуле концевого аргининового компонента [105, 146]. В связи с этим, не исключено, что в регуляцию метаболических процессов в мозге и органах может вовлекаться и аргинизированный предшественник лей-энкефалина (лей5-энкефалин-арг6). Установлено, что при периферическом введении повышенной проницаемостью ГЭБ, а, следовательно, и более выраженным воздействием на функциональные системы, характеризуются не сами биологически активные вещества, а их ближайшие предшественники [82]. Это обусловило использование в наших исследованиях лей5-энкефалин-арг6. Поскольку известно, что модулирующее действие экзогенных веществ зависит от исходного состояния физиологических систем и может по-разному проявляется при оптимальном и различных функциональных состояниях организма [107], то представляется необходимым исследование влияния лей5-энкефалин-арг6 на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у интактных животных.

Введение предшественника лей-энкефалина в дозе 20 мкг/кг массы крысы вызывало существенное повышение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ во всех исследованных отделах мозга и тканях по сравнению с контролем (табл.3, рис.4-6). Полученные данные свидетельствуют о вовлечении изучаемых ферментов в ответ организма на введение лей5-энкефалин-арг6.

Максимальное изменение активности ферментов в отделах мозга и периферических тканях обнаружено через 0,5 часа после инстилляции. Наиболее выраженное повышение активности КПН показано в гипофизе, ФМСФ-ингибируемой КП - в надпочечниках, АПФ - в семенниках.

Полученные нами данные (рис.4-6) указывают на наличие достаточно длительного влияния лей-энкефалин-арг на активность данных ферментов, что согласуется с уже проведенными исследованиями [59, 107, 113, 119] о пролонгированном действии многих регуляторных пептидов. Одним из механизмов, способствующих проявлению такого рода длительных эффектов является их связывание с белками-переносчиками [78], которые способны защищать пептид от достаточно быстрого действия протеаз. Постепенная диссоциация образующегося комплекса “пептид-носитель” приводит к поддержанию концентрации пептида на уровне, необходимом для реализации физиологических эффектов в течение достаточно длительных промежутков времени. Проявление длительных эффектов экзогенно вводимых веществ объясняют, также, на основе теории о функциональной непрерывности [59, 113]. Существенной особенностью которой является способность каждого регуляторного пептида индуцировать или ингибировать образование или деградацию других пептидов. Вследствие развивающихся при этом каскадов биохимических реакций, эффект экзогенного пептида будет проявляться и тогда, когда исходное вещество уже полностью разрушено. Однако эти сведения представлены только для активных пептидов. В нашей же работе пролонгированное действие наблюдалось и при введении предшественника лей-энкефалина - лей-энкефалин-арг. Не исключено что изучаемые ферменты - КПН, ФМСФ-ингибируемая КП и АПФ участвуют в биогенезе биологически активных пептидов, синтезируемых в ответ на введение лей-энкефалин-арг, выступающего в роли индуктора.

Длительное повышение активности КПН после введения лей-энкефалин-арг отмечено в гипофизе, стриатуме и гипоталамусе (табл.3, рис.4), где осуществляется синтез многих регуляторных пептидов [156, 221]. Наиболее существенное повышение активности КПН обнаружено в гипофизе. Вероятно, что экзогенно введенный лей-энкефалин-арг инициировал ряд последовательных реакций синтеза других регуляторных пептидов, в процессинге которых участвует КПН, что и вызывало длительное повышение активности изучаемого фермента.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10