Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе

В последнее время интенсивное развитие получило учение о пептидах - природных регуляторах, причем, именно малых пептидов, способных проникать в клетку, взаимодействуя с клеточными рецепторами. Быстрая реакция организма на введение пептидов, высокая биологическая активность, эндогенное происхождение - все эти важные качества привлекают внимание многих исследователей. Особенно интересны в этом отношении энкефалины.

Известно, что при периферическом введении нейромедиаторов, в том числе и опиоидных пептидов, отмечается общая закономерность: сами вещества практически не проходят ГЭБ, в то время как их ближайшие предшественники хорошо проникают в структуры мозга и вызывают соответствующие изменения в функционирование других систем, в частности тех, которые включаются в ответ организма на действие экстремального фактора [82]. Результаты этих работ явились определя-ющим фактором для использования в наших исследованиях предшественника лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6.

Известно, что экзогенное введение дополнительного источника жидкости приводит к изменению в функционировании пептидэргических систем, таких как ренин-ангиотензиновая, гипофизарно-надпочечниковая и опиоидэргическая [34, 86, 104, 125, 134], деятельность которых во многом определяется ферментами обмена биологически активных пептидов. Несомненно, что подобное воздействие отражается и на активности этих ферментов. Согласно данным исследований, при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в отделах мозга отмечается увеличение активности КПН [46]. Изменения такого характера могут быть связаны, прежде всего, с реакцией организма на введение избыточного количества жидкости, а также с развитием стрессорных повреждений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией. Показано, что введение физиологического раствора методом инстиляции на конъюнктиву глаза, является достаточно мягким способом введения, не травмирующим животное [119]. В связи с этим, а, также, учитывая тот факт, что нашим исследованием предусмотрено изучение механизмов возникновения и развития стресс-реакции, наиболее предпочтительным будет являться именно этот способ введения. Кроме того, метод инстилляции вещества на конъюнктиву глаза позволяет использовать минимальный объем жидкости, обеспечивает высокую вероятность проникновения вещества через ГЭБ [1, 24, 119], что предполагает активное включение вводимого вещества в обмен регуляторных пептидов в исследуемых регионах.

Активность исследуемых ферментов обмена нейропептидов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ - в мозге, надпочечниках и семенниках крыс определялась через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после инстилляции лей-энкефалин-арг в дозе 20 мкг/кг веса животного. Сравнение уровня активности ферментов при введении лей-энкефалин-арг проводилось относительно интактной группы животных (контроль). Полученные данные представлены в таблице 3 (приложение).

3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг.

При введении лей-энкефалин-арг во всех исследованных отделах мозга и тканях наблюдалось повышение активности КПН относительно контрольной группы животных (табл.3, рис.4). Наиболее выраженные изменения активности фермента обнаружены в гипофизе, стриатуме и надпочечниках. Статистически достоверные изменения активности КПН в исследованных отделах мозга и периферических тканях отмечены уже через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг. Кроме того, показано достаточно длительное действие исследуемого пропептида, что проявлялось повышением активности КПН до 72 часов после введения предшественника в отделах и тканях, связанных с образованием и секрецией биологически активных пептидов. Так в гипофизе активность фермента была выше соответствующих показателей контрольной группы животных через 0,5, 4, 24 и 72 часа на 152, 111, 64 и 78%, соответственно, p<0,001. Через 10 суток достоверных изменений не обнаружено. Сходная динамика изменения активности КПН обнаружена в среднем мозге, гипоталамусе, гиппокампе и больших полушариях, однако в них изменения носили менее выраженный характер. Максимальное повышение активности фермента отмечено также через 0,5 часа, затем активность КПН плавно снижалась. Через 10 суток статистически достоверных изменений обнаружено не было. В стриатуме, отделе, где синтезируются многие нейропептиды [62, 156, 221], изменения носили более выраженный характер, чем в других исследуемых отделах мозга и несколько отличались от последних динамикой. Так, активность КПН в них превышала соответствующие показатели группы контрольных животных через 0,5часа на 139%, p<0,001, через 4 часа активность снижалась (+56%, p<0,001), а через 24 и 72 часа отмечен всплеск активности КПН (+72%, p<0,001).

Сходная со стриатумом динамика изменения активности КПН показана в надпочечниках, органе связанном преимущественно с образованием энкефалинов, однако повышение активности КПН относительно контрольной группы животных было более выраженным. Активность фермента превышала контрольные показатели на 150, 100,130 и 80%, p<0,001, через 0,5, 4, 24 и 72 часа соответственно. В семенниках активность КПН была выше показателей контрольной группы животных на протяжении всех исследуемых промежутков времени и превышала их в 1,8-2 раза.

Таким образом, введение лей-энкефалин-арг вызывает в целом сходный характер изменения активности КПН: повышение через 0,5 часа и дальнейшее снижение с незначительными колебаниями, что свидетельствует о включении данного фермента в ответную реакцию организма на введение предшественника энкефалина.

3.3.2. Активность ФМСФ - ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг

При введении лей-энкефалин-арг во всех исследуемых отделах мозга и надпочечниках наблюдалось достоверное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с показателями контрольной группы (табл.3, рис.5). Наиболее выраженные изменения активности фермента обнаружены в надпочечниках и гипоталамусе. В семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП была ниже соответствующих контрольных показателей. Сходная динамика изменения активности фермента выявлена в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках. В гиппокампе, больших полушариях и семенниках изменения носили несколько иной характер.

Максимальное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП отмечено через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг. Наиболее выраженное повышение активности фермента показано в надпочечниках, где активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала показатели контрольной группы животных на 184%, p<0,001. Затем в порядке убывания исследуемые отделы располагаются следующим образом: гипоталамус (+130%, p<0,001), гиппокамп (+109%, p<0,001), в гипофизе и среднем мозге активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала контрольные показатели в 2 раза, p<0,001, в стриатуме на 88%, p<0,001, в больших полушариях на 46%, p<0,001. Через 4 часа статистически достоверное повышение активности зарегистрировано только в надпочечниках (+140%, p<0,001), среднем мозге (+74%, p<0,01), гипоталамусе (+52%, p<0,01), гипофизе (+37,5%, p<0,01) и стриатуме (+29%, p<0,01). Через 24 часа повышения активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с контрольными показателями обнаружено не было. Через 72 часа повышенная по сравнению с контролем активность фермента отмечена в гипофизе (+38%, p<0,05)

Таким образом, можно выделить следующие закономерности во влиянии лей-энкефалин-арг на активность ФМСФ - ингибируемой карбоксипептидазы: повышение активности фермента практически во всех отделах мозга и надпочечниках через 0,5 и 4часа и дальнейшее снижение ее. Наиболее существенное и длительное повышение активности фермента при введении лей-энкефалин-арг обнаружено в отделах, связанных с синтезом и секрецией регуляторных пептидов. Показанная динамика изменения активности фермента сходна с таковой КПН, что свидетельствует о включении ФМСФ-ингибируемой КП, наряду с КПН, в ответную реакцию организма на введение предшественника лей-энкефалина.

3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг

При однократной инстилляции лей-энкефалин-арг статистически достоверные отклонения в активности АПФ обнаружены в гипофизе, стриатуме и семенниках (табл.3, рис.6). В других отделах мозга и надпочечниках статистически значимых изменений активности фермента не отмечено.

Активность фермента в семенниках, гипоталамусе, стриатуме и гипофизе и через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг превышала показатели контрольной группы животных на 116, 83, 63 и 56% соответственно, p<0,001. Активность АПФ через 4, 24, 72 и 240 часов в стриатуме и гипофизе практически не отличалась от показателей интактной группы животных.

В семенниках отмечено более длительное влияние лей-энкефалин-арг на активность АПФ, здесь она превышала контрольные значения через 4 и 24 часа на 47%, p<0,01 и 26%, p<0,05 соответственно. Через 72 часа изменения уже не носили статистически достоверного характера.

Таким образом, динамика изменения активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг несколько отличается от таковой для КПН и ФМСФ-ингибируемой КП, как в отделах мозга, так и в периферических тканях. Что свидетельствует о специфической роли АПФ, в исследованных регионах. Показанное существенное и достаточно длительное повышение активности АПФ в семенниках при однократной инстилляции лей-энкефалин-арг, вероятно, свидетельствует о включении данного фермента в процессы синтеза биологически активных пептидов в данной ткани.

Сравнение уровня активности исследуемых пептид-гидролаз показывает наличие ряда сходных черт в динамике изменения активности ферментов. Так КПН и ФМСФ-ингибируемая КП практически во всех исследованных отделах мозга и тканях, а также АПФ в гипофизе, стриатуме и семенниках характеризуются достоверным повышением активности через 0,5 и 4 часа. Наиболее выраженный характер изменения носили в тех отделах мозга и органах, которые характеризуются повышенным содержанием таких регуляторных пептидов как ПВДС, энкефалины, вещество Р [156]. Увеличение активности исследуемых ферментов при введении лей-энкефалин-арг показано также в отделах синтезирующих нейропептиды. Полученные данные, свидетельствуют о включении КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в ответ организма на введение предшественника лей-энкефалина.

3.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ IN VITRO

Согласно литературным данным активность КПН in vitro ингибируется такими нейропептидами, как энкефалины, вазопрессин, вещество Р, окситоцин [207]. Подобное действие оказывают опиоидные пептиды и -липотропин на активность АПФ [160].

Особый интерес для выяснения механизмов действия экзогенно-введенного лей-энкефалин-арг представляет исследование in vitro влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ. Полученные данные представлены в таблице 3.

В опытах in vitro на изолированных надпочечниках, гипофизе и больших полушариях обнаружено, что добавление лей-энкефалин-арг в концентрации 2,4мМ, приводит к подавлению активности КПН и АПФ. Более выраженное подавление активности КПН и АПФ обнаружено в надпочечниках. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в изолированных надпочечниках, гипофизе и больших полушариях in vitro практически не изменяется по сравнению с контрольными пробами.

Как было показано выше, в опытах in vivo активность ферментов при инстилляции пропептида повышалась. Обнаруженное несоответствие во влиянии лей-энкефалин-арг на активности изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов in vitro и in vivo показывает, что влияние предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ опосредовано.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ НА ФОНЕ ОСТРОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА.

Известно, что коррекция последствий острых стресс-воздействий с использованием традиционных средств в большинстве случаев не достаточно эффективна. Наблюдаемая после воздействия стресса несоответствие процессов синтеза и секреции многих регуляторных пептидов, а также блокада их рецепторов продуктами метаболизма приводит к истощению нейрогуморальных систем [22, 106, 111, 176]. Одним из способов естественной профилактики повреждений, вызванных чрезмерной реакцией на действие экстремальных факторов, является активация эндогенной стресс-лимитирующей системы опиоидных пептидов за счет их экзогенного введения [116, 135]. Однако полифункциональность опиоидов, становится лимитирующим фактором для их применения при различных патологиях ЦНС. Известно, что введение извне энкефалинов, их предшественников и синтетических аналогов, устойчивых к действию пептидгидролаз, может в значительной мере ослабить или даже устранить патологические изменения в условиях разных видов стресс-воздействия [23, 69, 102]. При этом, особенности фармакологического действия энкефалинов зависят от их энзимоустойчивости и стабильности в крови, способности проникать через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ).

Известно, что при стрессе предварительное введение лей-энкефалина или его синтетического аналога даларгина уменьшает подъем уровня кортикостерона в организме - одного из компанентов стресс-реализующих систем [69, 105, 123]. Полагают, что экзогенно вводимые опиоидные пептиды могут способствовать “запуску” ряда эндогенных реакций синтеза или деградации других биологически активных пептидов, в том числе и обладающих антистрессорным действием [11, 13, 78, 113, 119]. Известно, что образование и инактивация регуляторных пептидов осуществляется при участии ферментов пептид-гидролаз.

В связи с вышесказанным интересным представляется исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов в динамике острого ЭБС.

Проведены исследования влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс, подверженных острому ЭБС. Предшественник лей-энкефалина вводился непосредственно перед началом стрессирования в дозе 20 мкг/кг веса животного. Активность ферментов в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс определяли через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после совместного воздействия пропептида и острого ЭБС. Сравнение полученных данных проводилось относительно соответствующих показателей активности ферментов интактных и животных, подверженных ЭБС. Результаты исследования представлены в таблицах 5-7 (приложение) и рис. 7-9.

3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС.

Данные проведенных исследований (табл.5, рис. 7) показывают, что при введении предшественника лей-энкефалина стрессированным животным, активность КПН изменяется в тех отделах мозга, которые, по классическим представлениям, связаны с синтезом стресс-протективных веществ [14, 140, 156, 185]. Наиболее выраженное повышение активности фермента, по сравнению и группой интактных животных, обнаружено в гипофизе, стриатуме, гипоталамусе и больших полушариях. Существенное повышение активности отмечено также в семенниках. Как было показано выше (раздел 3.2.1.) активность КПН в гипофизе и стриатуме при воздействии острого ЭБС также повышается.

Однако, как показывают данные проведенных исследований, изменения активности КПН у группы животных, которым на фоне стресса вводился лей-энкефалин-арг отличается от таковых при воздействии острого ЭБС по динамике и степени выраженности.

Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресс-воздействия предотвращало повышение активности КПН в гипофизе (табл.5, рис.7). Активность фермента через 0,5 и 4 часа не отличалась от нормы. Через 24 и 72 часа она была выше активности фермента у интактных животных на 21% (p<0,05) и 40% (p<0,01), соответственно (рис.7). Однако повышение активности КПН было меньшим по сравнению с животными, не получавшими лей-энкефалин-арг перед стрессом (рис.7). Через 10 суток статистически значимых изменений активности фермента, по сравнению с нормой и с стрессированными животными, обнаружено не было.

В стриатуме через 0,5 и 4 часа активность КПН превышала показатели интактных животных на 28% (p<0,001) и 33%(p<0,01) и стрессированных животных на 28% (p<0,01) и 20% (p<0,01), соответственно (табл.5, рис.7). Через 24 часа не отличалась от активности фермента у обеих сравниваемых групп. Через 72 часа активность КПН была выше нормы на 39% (p<0,01) и не отличалась от таковой при стрессе. Через 10 суток после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и острого ЭБС активность фермента не отличалась показателей нормы и стрессированных животных.

Статистически достоверное повышение активности КПН, как по сравнению с интактными животными, так и по сравнению с группой животных, подверженных воздействию острого ЭБС, отмечено через 4 часа в больших полушариях - отделе, характеризующимся высоким содержанием нейропептидов (табл.5, рис.7). Активность фермента при этом превышала соответствующие показатели на 33%( p<0,01).

Предварительное введение перед стрессом лей-энкефалин-арг предотвращало снижение активности КПН в среднем мозге и гиппокампе через 4 часа после воздействия. Активность фермента при этом практически не отличалась от нормы и превышала соответствующие показатели стрессированных животных на 33%( p<0,01) в среднем мозге и на 63% (p<0,001) в гиппокампе (рис.7). Через 0,5, 24 , 72 часа и 10 суток после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и стресса не отличалась от таковой у обеих сравниваемых групп (рис.7).

В надпочечниках через 0,5, 24, 72 часа и 10 суток активность КПН не отличалась от соответствующих показателей стрессированных и интактных животных, а через 4 часа была выше таковой, у животных подверженных воздействию острого ЭБС (+117%, p<0,001) и не отличалась от нормы (рис.7).

В семенниках после совместного воздействия двух факторов обнаружены статистически достоверные отличия от группы интактных животных. Активность КПН в них через 0,5 и 4 часа превышала соответствующие показатели нормы на 50%, p<0,01 (рис.7).

Таким образом, предварительное введение лей-энкефалин-арг способом инстилляции на конъюнктиву глаза животным перед острым ЭБС предотвращало, обнаруженное при стрессе, повышение активности КПН в гипофизе, понижение активности фермента в среднем мозге и гиппокампе, и, напротив, приводило к повышению активности фермента в стриатуме гипоталамусе и больших полушариях.

Полученные данные показывают, что при совместном воздействии острого ЭБС и предшественника лей-энкефалина изменения в активности КПН во всех исследованных регионах мозга и тканях, носят менее выраженный характер, чем при воздействии только лей-энкефалин-арг, где активность фермента повышается в 1,5-2 раза (рис.4).

3.5.2. Активность ФМСФ - ингибируемой КП при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.

При введении предшественника лей-энкефалина стрессированным животным во всех исследованных отделах мозга и тканях отмечено повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с нормой (табл.6, рис.8). Динамика изменения активности несколько отличается от таковой для КПН. Кроме того, следует отметить, что если при воздействии острого ЭБС повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП, по сравнению с нормой, обнаружено через 72 часа, то при совместном действии двух факторов изменения такого рода отмечаются уже через 0,5 часа после начала воздействия. Затем активность ФМСФ-ингибируемой КП плавно снижается и через 24 часа приближается к норме. Через 72 часа и 10 суток активность фермента во всех отделах мозга и тканях (исключение семенники) близка к показателям интактных крыс.

Наиболее выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с группой интактных и стрессированных животных отмечено в гипофизе и больших полушариях (рис.8) через 0,5 часа после совместного воздействия пропептида и острого ЭБС. Активность фермента в гипофизе и больших полушариях была выше нормы на 26,5 и 26% (p<0,05) (рис.8), соответственно и превышала соответствующие показатели стрессированных животных на 46 % (p<0,05) и 38% (p<0,01) (рис.8). В другие промежутки времени статистически достоверных отличий не обнаружено, т.е. показатели активности были близки к соответствующим показателям интактных животных. Обнаруженного после воздействия острого ЭБС повышения активности КПН через 72 часа (рис.2) не отмечено (рис.8). Активность фермента в гипофизе и больших полушариях через 72 часа после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и острого ЭБС была ниже соответствующих показателей стрессированных животных на 26% (p<0,01) и 30% (р<0,001), соответственно (рис.8).

Динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках при воздействии предшественника лей-энкефалина и острого ЭБС была сходной с таковой в гипофизе и больших полушариях, однако, изменения были менее выражены (рис.8). Активность фермента в них также превышала показатели животных, подверженных воздействию острого ЭБС и интактных животных через 0,5 часа на 21% (p<0,05) и 15% (p<0,05), соответственно.

В гипоталамусе, гиппокампе и семенниках при введении пропептида стрессированным животным активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала показатели обеих сравниваемых групп через 0,5 и 4 часа, 0,5 часа и 4, 24 и 72 часа, соответственно (рис.8).

Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресса вызывало существенное по сравнению с стрессированными животными повышение активности в среднем мозге через 0,5 и 4 часа на 41% (p<0,01) и 24% (p<0,05), соответственно (рис.8). Активности фермента при этом практически не отличалась от интактных животных (рис.8).

Сходная тенденция наблюдалась в стриатуме, здесь активность ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа превышала соответствующие показатели группы животных, подвергавшихся воздействию острого ЭБС на 32%, p<0,05 и не отличалась от нормы во все исследуемые промежутки времени. Введение предшественника лей-энкефалина предотвращало обнаруженное при стрессе повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в стриатуме через 72 часа (рис.8).

Таким образом, практически во всех исследованных регионах мозга введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Активность фермента при этом была близка к норме.

Данные исследований показывают, что во всех исследованных отделах мозга и тканях активность ФМСФ-ингибируемой КП при совместном воздействии стресса и лей-энкефалин-арг (рис.8) была ниже соответствующих показателей активности фермента животных, которым инстиллировался предшественник пептида (рис.5).

3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.

Полученные данные об изменение активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг стрессированным животным представлены в таблице 7 (приложение) и на рис. 9.

Результаты исследования показывают, что при предварительном введение проэнкефалина статистически достоверные отличия от группы интактных животных обнаружены только в гипофизе. Показатели активности АПФ при этом выше таковых у интактных животных через 24 часа на 36%, p<0,05 (рис.9).

При сравнении изменений активности АПФ при совместном действии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС с соответствующими показателями стрессированных животных статистически достоверные отклонения обнаружены в гипофизе через 24 часа и в стриатуме через 4 часа (рис.9). Активность АПФ при предварительном введении лей-энкефалин-арг перед стрессом была выше показателей активности стрессированных животных на 36% (p<0,001) и 40% (p<0,05), соответственно. В другие исследованные промежутки времени статистически достоверных изменений не обнаружено.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10