Взаимодействие низкомолекуляных соединений с мембранами

Как это ни удивительно, вода может довольно легко проникать через фосфолипидный слой. Данные однозначно показывают, что внутри мембраны в гидрофобной ее области воды практически нет. Коэффициент распределения для воды в гексадекане не противоречит этому выводу, поскольку предсказывает, что концентрация воды в мембране должна быть порядка нескольких миллимолей, т. е. на 103 молекул фосфолипида должна приходиться примерно одна молекула воды. Кроме того, из значения коэффициента проницаемости следует, что при движущей силе, соответствующей трансмембранной разности концентраций 0,1 М, скорость потока воды должна составить около 10--100 молекул в секунду на молекулу фосфолипида. Как следует из рис. 3, по сравнению с другими неэлектролитами проницаемость фосфолипидного бислоя для воды выше, но не намного. Константа скорости для потока воды составляет 10б с ~ 1, т. е. молекула воды диффундирует через всю толщину мембраны всего за 1 мкс. Таким образом, очень маленькая стационарная концентрация воды в гидрофобной области мембраны вполне согласуется с наличием весьма интенсивного ее потока через бислой.

Не исключено также, что концентрация воды в гидрофобной области бислоя выше, чем оцениваемая исходя из данных о коэффициенте распределения. Более того, в ряде работ высказывается предположение о существовании в мембране временных трансбислой-ных цепочек из молекул воды, соединенных водородными связями. Предполагается, что такие структуры играют роль проводников протонов через мембрану.

Транспорт воды через липидный бислой можно также изучать, используя и однослойные везикулы. Такие везикулы представляют собой прекрасные осмометры. Если концентрация соли внутри них выше, чем снаружи, то поток воды будет направлен внутрь везикулы, что приведет к созданию осмотического давления и последующему набуханию липосом. При набухании везикулы могут увеличиваться в радиусе вплоть до 5% и при этом оставаться стабильными, но степень набухания в очень большой степени зависит от размеров везикулы.

Проницаемость биомембран для воды обычно раз в 10 выше, чем проницаемость модельных мембран. Наиболее детально изучены в этом отношении эритроциты. Как показано в целом ряде лабораторий, обработка мембран эритроцитов сульфгидриль-ным реагентом л-хлормеркурийбензосульфонатом приводит к инги-бированию транспорта воды, уменьшая проницаемость для нее до уровня, характерного для липидного бислоя. По-видимому, этот SH-реагент действует на белок полосы 3, а возможно, и на белок полосы 4.5 анионного канала эритроцитов. По-видимому, проницаемость эритроцитарных мембран для воды обусловлена главным образом транспортом через канал, образуемый белком анионного переносчика. Аналогичные результаты были получены для препаратов мембран почек, откуда следует, что каналы для воды имеются и в этой системе.

3. Электрические свойства мембран

Прежде чем перейти к обсуждению проницаемости липидного бислоя для ионов, рассмотрим электрические свойства мембран. Нам нужно найти суммарный трансмембранный электрический потенциал, что позволит оценить работу, необходимую для перемещения заряда из одной точки в другую. Это нужно для понимания механизма перемещения ионов через мембрану и для анализа распределения зарядов внутри мембраны и у ее поверхности. Это могут быть ионы, находящиеся в водной фазе у поверхности бислоя или на границе раздела фаз мембрана--вода, а также белки с заряженными аминокислотными остатками.

Напомним некоторые определения.

Число Фарадея F -- это заряд одного моля одновалентного иона:

F = Число АвогадроЭлементарный заряд =

= -1,602-10" 19 кулон = 105 кулон/моль.

Электрическое напряжение V. Применительно к мембранам термины «напряжение», «потенциал», «разность потенциалов» и «разность напряжений» эквивалентны. Напряжение -- это электрическая работа, необходимая для перемещения заряда из одной точки пространства в другую. Напряжение 1 В соответствует разности потенциалов, для перемещения против которой заряда, равного 1 Кл, нужно совершить работу в 1 Дж. При измере

нии напряжения всегда нужна некая точка отсчета. Для мембран обычно в качестве такой точки берется точка, расположенная очень далеко от поверхности мембраны, и потенциал в ней принимается равным нулю.

Сила тока I измеряется в амперах; один ампер по определению равен одному 1 Кл/с.

Проводимость или сопротивление характеризует сопротивление потоку заряженных частиц, направленному от одной точки к другой. Эти величины определяются из закона Ома, связывающего силу тока с разностью потенциалов:

Проводимость измеряется в сименсах, а обратная ей величина -- сопротивление -- в омах. Проводимость 1 См означает, что при изменении разности потенциалов на 1 В сила тока изменяется на 1 Клс-1.

Удельное сопротивление q используется для характеристики гомогенных проводящих сред, в частности для описания ионного потока через заполненные водой мембранные каналы. Удельное сопротивление -- это электрическое сопротивление среды между двумя электродами площадью 1 см2, находящимися друг от друга на расстоянии 1 см. Размерность удельного сопротивления -- Ом-см. Сопротивление среды между двумя электродами площадью А, находящимися на расстоянии х друг от друга, можно определить по формуле

6. Емкость С. Для создания разности потенциалов между двумя
точками, в частности между двумя сторонами бислоя, достаточно
просто разделить заряды между этими точками. Емкость -- это ве-
личина разделенных зарядов, необходимая для создания определен-
ной разности потенциалов:

С = Q/V,

где Q -- величина заряда с каждой стороны мембраны, положительного с одной и отрицательного с другой, V -- создаваемая разность потенциалов. Емкость измеряется в фарадах. Емкость мембраны -- очень важная электрическая характеристика, поскольку она определяет, какое количество зарядов нужно перенести через мембрану, чтобы создать на ней определенное напряжение. Удельная емкость равна емкости единицы площади и зависит от количества зарядов, разделенных на единице площади мембраны.

В первом приближении бислойную мембрану можно предста-

вить в виде тонкой пластины из непроводящего материала, разделяющей два водных раствора. Таким образом, мембрана является обычным плоским конденсатором, в котором заряды находятся на двух границах раздела фаз мембрана--вода. Емкость такого конденсатора зависит только от расстояния между двумя заряженными поверхностями и диэлектрической проницаемости материала между этими поверхностями. Диэлектрическая проницаемость характеризует поляризуемость материала, т. е. то, насколько эффективно помещенный в среду из этого материала постоянный электрический диполь «чувствует» приложенное электрическое поле. Большая диэлектрическая проницаемость формально означает «компенсацию» части зарядов на поверхности мембраны, так что для создания одной и той же разности потенциалов в случае большой е необходимо перенести через мембрану ббльший заряд.

где Јо -- так называемая абсолютная диэлектрическая проницаемость, т. е. диэлектрическая проницаемость вакуума, равная 8,85-10~12 Кл-В_1-м~. Для фосфолипидных бислоев и биомембран измеряемые значения удельной емкости примерно равны и составляют около 1 мкФ/см2, что соответствует диэлектрической проницаемости е = 2 при толщине около 25 А. В отличие от емкости электрическое сопротивление мембраны зависит от ее типа и от числа ионных каналов и для разных мембран варьирует в широких пределах.

Теперь мы можем перейти к определению суммарного трансмембранного электрического потенциала. Работа, необходимая для перемещения заряда, который находится на бесконечно большом расстоянии от мембраны, к поверхности мембраны, а затем в гидрофобную область бислоя, имеет следующие составляющие.

Работа, связанная с переносом заряда из среды с одной диэлектрической проницаемостью в среду с другим ее значением. Необходимость совершения такой работы связана с различием в поляризации диполей этих сред, и именно этим в значительной степени обусловлена дестабилизация зарядов в гидрофобной области мембраны.

Дипольный потенциал. Основной вклад вносят, по-видимому, ориентированные карбонильные группы фосфолипидных молекул. Возможно, определенную роль играют и ориентированные молекулы воды.

Поверхностный потенциал. Создается заряженными группами на поверхности мембраны.

Трансмембранный потенциал. Образуется за счет разделения

зарядов между водными фазами по разные стороны мембраны. Ои может создаваться в результате работы электрогенных ионных насосов или благодаря пассивной проницаемости бислоя для ионов в равновесных или стационарных условиях.

Рассмотрим вкратце каждый из этих компонентов.

3.1. РАБОТА, СОВЕРШАЕМАЯ ПРИ ПЕРЕНОСЕ ИОНА ВНУТРЬ БИСЛОЙНОЙ МЕМБРАНЫ

Любой ион в воде стабилизируется благодаря взаимодействиям с диполями воды. Перемещение иона из воды в центр мембраны энергетически невыгодно, поскольку сопряжено с затратами энергии на освобождение иона от гидратной оболочки. Наиболее адекватной количественной моделью такого перехода является модель Борна. Работа, необходимая для переноса иона с зарядом q и радиусом г из среды с диэлектрической проницаемостью Ј2 в среду с диэлектрической проницаемостью Е\, определяется по формуле

Диэлектрическая проницаемость воды равна 80; для внутренней части мембраны обычно используют характерную для углеводородов величину Јi = 2. Тогда работа, совершаемая при переносе иона с валентностью Z, составит W = ккал/моль. То есть для_ перемещения внутрь мембраны одновалентного иона радиусом 2 А нужно затратить 40 ккал/моль. Ясно, что такое перемещение энергетически весьма невыгодно, иными словами, бислой является труднопреодолимым барьером для ионов. Отметим, однако, что ионы большого радиуса весьма эффективно могут стабилизироваться в мембране. Это помогает понять, каким образом про^' никают через мембрану такие ионы, как I3~ SCN" и заряженные комплексы ионов с ионофорами.

Помимо энергии Борна имеется еще один компонент, связанный с возникновением на границе с диэлектриком сил поляризации. Появление заряда по одну сторону от границы раздела фаз вызывает переориентацию диполей в среде по другую сторону мембраны. Соответствующая энергия называется энергией «отображения». Для мембран она соответствует только 10--15%-ному уменьшению энергии Борна.

Все упомянутые модели рассматривают мембрану как простой слой диэлектрика. Ясно, однако, что находящиеся по краям бислоя полярные головки создают слой толщиной около 10 А, существенно отличающийся по своим свойствам от гидрофобного центра.

Диэлектрическая проницаемость в этой области должна измениться от 2 по одну сторону до 80 -- по другую; в качестве средней величины приводятся значения от 10 до 30. Согласно модели, в это значение вносит свой вклад вращение полярных фосфолипидных головок. Гидрофильные области мембран интересны еще и тем, что именно здесь происходит связывание многих мембранных зондов и амфифильных молекул.

3.2. ПОТЕНЦИАЛ ВНУТРЕННИХ ДИПОЛЕЙ

Как показывают экспериментальные и теоретические данные, ориентированные диполи на поверхности мембраны создают в центре фосфолипидного бислоя потенциал, равный примерно 240 мВ, положительный внутри. Это эквивалентно вкладу в свободную энергию 5,5 ккал/моль, положительному для катионов и отрицательному для анионов. Полярные фосфохолиновые головки ориентированы параллельно плоскости мембраны и не должны ни при каких условиях образовывать диполи, направленные положительным концом внутрь мембраны, поскольку для этого положительно заряженный остаток холина должен располагаться ближе к центру бислоя, чем отрицательно заряженный фосфат. Вероятнее всего, внутренние диполи связаны с ориентированными карбонильными группами эфирных связей фосфолипидных молекул. Влияние этого потенциала на профиль потенциальной энергии, по-видимому, ограничивается лишь внутренней частью мембраны и проиллюстрировано на рис. 7.4.

При транспорте ионов небольшого размера, например Na+ и О ", это приводит к тому, что высота энергетического барьера для транспорта анионов через бислой оказывается несколько меньшей, чем для транспорта катионов. Тем не менее, для небольших ионов любого заряда этот барьер остается достаточно высоким, а результирующие коэффициенты проницаемости через бислой -- очень малыми.

Все сказанное не распространяется на такие гидрофобные ионы, как ТФФ+ и ТФБ~. У этих ионов заряд окружен неполярными группами, и благодаря вкладу гидрофобной компоненты в суммарное изменение свободной энергии коэффициент распределения для этих ионов сильно сдвинут в пользу мембраны. Гидрофоб-ность окружения позволяет скомпенсировать большую часть электростатической энергии. Кроме того, сама энергия Борна для этих ионов меньше из-за их относительно больших размеров. Профиль свободной энергии для гидрофобных ионов также показан на рис. 7.4. Как видно из этих данных, гидрофобная компонента свободной энергии для обоих ионов составляет около - 7 ккал/моль, а взаимодействие с внутренними диполями приво-

дит к стабилизации гидрофобных анионов в бислое. Обратите внимание на минимумы в профиле потенциальной энергии, соответствующие связыванию гидрофобных анионов вблизи поверхности мембраны -- в той области, где локализуются эфирные группы фосфолипидов.

В результате влияния потенциала внутренних диполей гидрофобные анионы значительно прочнее связываются с бислоем и легче проникают через мембрану, чем гидрофобные катионы, имеющие очень близкую структуру: коэффициенты проницаемости для них различаются на шесть порядков, а константы связывания с бислоем -- на четыре-пять порядков.

При связывании некоторых гидрофобных ионов с фосфатидилхолиновым бислоем наблюдается насыщение при концентрации ионов ~ 1 молекула на 100 молекул ли-пида. Это обусловливается электростатическим отталкиванием за счет поверхностного потенциала, образующегося при связывании ионов с поверхностью бислоя.

3.3. ПОВЕРХНОСТНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕМБРАНЫ

Поверхность большинства биомембран отрицательно заряжена в основном благодаря присутствию кислых фосфолипидов: обычно 10--20% мембранных липидов находятся в форме анионов. Отрицательным зарядом обладают и другие мембранные компоненты, например ганглиозиды или белки. Так, суммарный отрицательный заряд мембран тилакоидов в основном обусловлен белками. Отрицательно заряженные группы, например фосфатные или карбоксильные, фиксированы на поверхности мембраны, и, естественно, их заряд нейтрализуется Противоионами. Однако противоионы подвижны, а не закреплены жестко на поверхности мембраны; их концентрация меняется в объеме водной фазы таким образом, что устанавливается определенный баланс между стремлением ионов к равномерному распределению по объему вследствие энтропийного фактора и электростатическим притяжением к поверхностным зарядам. В результате противоионы локализуются не на самой поверхности мембраны, а на некотором расстоянии от нее, создавая так называемый двойной диффузионный слой. С физической точки зрения он представляет собой поверхность мембраны с фиксированной плотностью зарядов и диффузное облако противоионов вблизи нее. Электрический потенциал в околомембранном слое раствора является функцией поверхностной плотности заряда, а также концентрации и валентности иоиов в растворе. Наличие поверхностного потенциала приводит к ряду важных последствий, которые можно проверить экспериментально и объяснить с помощью довольно несложных теоретических построений. Мы не будем останавливаться на выводе соответствующих соотношений, а сконцентрируем свое внимание на тех последствиях, к которым приводит существование фиксированных зарядов на поверхности мембраны.

В теоретическом плане задача состоит в определении величины электрической потенциальной энергии как функции расстояния от поверхности мембраны. После нахождения этой зависимости можно вычислить локальную концентрацию любого иона и количественно описать любое связанное с поверхностным потенциалом явление, например электрофоретическую подвижность везикул или электростатическое притяжение между двумя соседними мембранами. Соответствующая теория разработана в начале века Пои и Чапменом, а позднее, в 20-х гг., дополнена Штерном. Эта теория, получившая название теории Пои--Чампена или Пои--Чапмена-- Штерна, весьма успешно описывает связанные с заряженной мембраной электростатические эффекты.

В основу теории Гюи--Чапмена положены четыре предположения: 1) заряды равномерно распределены по поверхности мембраны; 2) ионы в растворе являются простыми точечными зарядами пренебрежимо малых размеров; 3) так называемые эффекты отображения -- притяжение подвижных ионов при приближении к поверхности диэлектрика -- считаются пренебрежимо малыми; 4) диэлектрическая проницаемость водной фазы считается величиной постоянной, одинаковой на поверхности мембраны и в объеме раствора. Каждое из этих предположений было проверено экспериментально и показано, что все они вполне разумны. Дополнение Штерна учитывает размеры связанных с поверхностью противоионов, что дает верхний предел числа ионов, которые физически могут связаться с мембраной.

Теоретические предсказания удобнее всего проиллюстрировать графически. На рис. 5 приведен профиль электрического потенциала в среде, содержащей соль одновалентных металлов в концентрации 0,1 М при разной поверхностной плотности заряда. Один заряд на 300 А2 соответствует примерно 20 мол.% отрицательно заряженного фосфолипида, а один заряд на 60 А2 -- би-слою из чисто отрицательного заряженного липида. Как можно видеть из рисунка, электростатические эффекты распространяются на довольно значительные расстояния от поверхности мембраны. Потенциал на поверхности мембраны называется поверхностным, ¦о, и, очевидно, является функцией поверхностной плотности заряда. Рис. 7.5 иллюстрирует также влияние увеличения концентрации соли одновалентного металла в растворе. При высоких концентрациях соли электростатические эффекты в значительной мере нивелируются. При этом наблюдается уменьшение как поверхност-

ного потенциала, так и эффективного расстояния, на которое простирается двойной электрически слой. Как следует из теории, для двухвалентных ионов экранирующий эффект выражен еще сильнее: влияние на поверхностный потенциал мембраны двухвалентных катионов, например Са2+, проявляется при значительно меньших концентрациях, чем одновалентных. Эффекты, которые иллюстрирует рис. 7.6, не связаны с сорбцией ионов на поверхности мембраны, а обусловлены только экранированием. Наблюдаемое же довольно часто связывание двухвалентных катионов с заряженными группами на поверхности мембраны приводит к еще более выраженному уменьшению поверхностного потенциала.

Рис. 7 иллюстрирует влияние электрического потенциала на распределение анионов и катионов в растворе. Локальную концентрацию любого иона при известном электрическом потенциале несложно найти с помощью уравнения Больцмана:

где С и if -- концентрация иона и электрический потенциал на расстоянии х от поверхности мембраны, С -- концентрация иона на бесконечном расстоянии от поверхности, Z-- валентность иона, F-- постоянная Фарадея. Потенциал 60 мВ при 25 °С соответствует примерно десятикратному изменению концентрации иона. Отметим еще раз, что значительное влияние на концентрационный профиль оказывает входящий в показатель экспоненты заряд иона Z.

С влиянием поверхностного потенциала связывают целый ряд самых разнообразных наблюдаемых в эксперименте эффектов. Можно считать экспериментально доказанным, что под влиянием поверхностного мембранного потенциала ¦о концентрация ионов в околомембранном слое изменяется в соответствии с теорией Гюи--Чапмена. Это касается протонов, ионов металлов и органических ионов.

Локальное значение рН на поверхности мембраны

Концентрация ионов вблизи отрицательно заряженной поверхности мембраны выше, чем концентрация в объеме, которую измеряют с помощью рН-метра. Поэтому кажущееся значение рКа любой группы на поверхности отличается от истинного рКл. Это касается, в частности, и титруемых групп самих фосфолипидов. На рис. 7.8 приведены кривые титрования карбоксильных групп

фосфатидилсерина, включенного в фосфатидилхолиновые везикулы. Кажущееся рКл составляет 4,7 при 10 мМ NaCl и 3,9 при 100 мМ NaCl. Это различие обусловлено не изменением истинного значения рКл этой группы, а увеличением концентрации Н + на поверхности мембраны при низкой ионной силе из-за увеличения if о- Истинное значение рКл по оценкам должно составлять 3,6, а зависимость рКл от концентрации ионов очень хорошо описывается теорией Гюи-- Чапмена. Локальное значение рН вычисляли по уравнению, приняв х = 0. Близкие результаты были получены с использованием помещенных на поверхность мембраны рН-индикаторов. Было показано, что значение локального околомембранного рН отличается от рН в объеме на величину, предсказываемую теорией Гюи--Чапмена.

Истинное и кажущееся значения рКа группы на поверхности мембраны

Константа диссоциации рКл для протонирования группы на поверхности мембраны определяется следующим образом:

Связывание ионов металлов

Физиологическая значимость взаимодействия фосфолипидов с ионами металлов, в частности с Са2+, не вызывает сомнений, и таким взаимодействиям было посвящено значительное число исследований. Для ответа на вопрос о том, как ионы металлов связываются с фосфолипидным бислоем и изменяют структуру мембраны, был привлечен целый ряд экспериментальных методов, в частности калориметрия, рамановская и инфракрасная спектроскопия, дифракция нейтронов и рентгеновских лучей, 31Р-ЯМР и 2Н-ЯМР. В табл. 2 приведены истинные константы диссоциации для некоторых катионов металлов, связанных с кислыми или цвиттерионными липидами. Некоторые из этих величин получали, регистрируя изменение поверхностного потенциала при связывании ионов металлов с фосфолипидными везикулами. Связывание катионов приводит к уменьшению плотности отрицательных зарядов в случае кислых фосфолипидов либо к увеличению плотности положительных зарядов в случае везикул из цвиттерионных липидов. И в той и в другой системах для анализа данных применима теория Гюи--Чапме-на. Истинные константы связывания рассчитывали, исходя из концентрации свободных ионов вблизи поверхности мембраны, которая в свою очередь зависит от поверхностного потенциала, а саму константу диссоциации определяли из уравнения, аналогичного. Здесь стоит остановиться на нескольких моментах.

Одновалентные ионы, например натрий, действительно свя-зываюется с кислыми фосфолипидами, но с низким сродством.

Истинное сродство Са2+ к поверхности цвиттерионных фосфолипидных везикул близко или чуть меньше, чем к поверхности кислых фосфолипидов. Более сильное связывание Са2+ с кислыми фосфолипидами обусловлено не ббльшим сродством к ним Са2 +, а скорее всего электростатическим эффектом более высокой плотности отрицательных зарядов, приводящим к возрастанию локальной концентрации Са2+ на поверхности.

Связывание как одно-, так и двухвалентных катионов, по-видимому, почти не влияет на конформацию полярных головок фосфолипидов, по крайней мере для фосфатидилхолина и фосфатидилглицерола. При связывании с фосфатидилсерином наблюдается иммобилизация карбоксильных групп.

Обычно Са2+ связывается с фосфолипидами в стехиометрии 1:1, хотя в случае фосфатидилхолина один ион Са2+ связывается с двумя молекулами липида. По-видимому, образуется и комплекс со стехиометрией 1:2, когда в результате связывания металла происходит агрегация мембран; при этом двухвалентный катион может служить мостиком между двумя плотно прижатыми поверхностями мембраны.

Связывание Са2+ может приводить к изменению физического состояния липида. Например, связывание Са2+ с фосфатидилсерином или фосфатидной кислотой может сопровождаться переходом бислоя в фазу геля, а при взаимодействии с кар-диолипином стабилизируется гексагональная фаза. Если везикулы состоят из смеси кислых и цвиттерионных липидов, то связывание с Са2+ вызывает латеральное разделение фаз; при этом могут образовываться обширные домены в однослойных везикулах.

Страницы: 1, 2, 3