Принципы биохимического исследования

Принципы биохимического исследования

Реферат

Принципы биохимического исследования

Введение

Основная задача биохимии -- объяснить, как функционируют живые системы с точки зрения процессов, протекающих в клетках. Все клетки в организме находятся в состоянии динамической активности и подвергаются действию внутренних и внешних факторов, которые в свою очередь также постоянно изменяются. В процессе жизнедеятельности любая отдельно взятая клетка взаимодействует с другими клетками, находящимися как в непосредственной близости от нее (межклеточные взаимодействия), так и на некотором расстоянии (гормональные эффекты). Функционирование органеллы внутри клетки также в значительной степени зависит от активности других органелл и окружающей цитоплазмы. Ясно поэтому, что нельзя достаточно полно изучить живую клетку, если делать это в отрыве от целого организма.

Интенсивные исследования, расширяющие и углубляющие наши знания о многочисленных процессах, протекающих в живом организме, ведутся в области фармакологии, микробиологии, патологии и других наук. Биохимия изучает эти процессы главным образом на уровне клетки и клеточных структур, однако полученные результаты должны рассматриваться также на уровне органов, тканей, всего организма и даже во взаимосвязи организма с окружающей средой.

Изучение любой последовательности взаимосвязанных процессов, протекающих в какой-либо биологической системе, начинают, как правило, с изучения ее компонентов. Для этого компоненты обычно выделяют, всесторонне их исследуют и пытаются понять, как они функционируют в составе организма.

Процессы, характерные для целой клетки, протекают в отдельных клеточных частицах и органеллах, которые для анализа выделяют из клетки с помощью фракционирования. Этот процесс обычно состоит из двух этапов (разд. 1.10.3): сначала клетки разрушают, а затем из образовавшейся суспензии методом центрифугирования (гл. 2) выделяют нужные частицы и органеллы. Дальнейшее разделение индивидуальных компонентов клеточных частиц и органелл и изучение их свойств проводят с помощью центрифугирования (гл. 2), хроматографии (гл. 3) или электрофореза (гл. 4). Для определения состава, механизма действия и функций клеточных компонентов пользуются сложными количественными и качественными аналитическими методами. На атомном и молекулярном уровнях применяют целый ряд спектральных методов (гл. 5); механизм действия клеточных частиц и внутриклеточные взаимодействия изучают, используя одновременно несколько аналитических методов, таких, как спектроскопия (гл. 5) и радиоизотопные методы (гл. 6), потенциометрия, полярография (гл. 7) и манометрия (гл. 8).

При фракционировании нормальная активность клетки может в значительной степени нарушаться. Чтобы свести последствия фракционирования до минимума и приблизить условия к естественным, применяют особые приемы (разд. 1.10.1). Однако все побочные явления, возникающие в ходе фракционирования, устранить невозможно, поэтому полученные результаты следует трактовать весьма осторожно, особенно если речь идет о целой клетке, органе или организме.

1. рН среды и буферные растворы

1.1 Влияние рН на биологические процессы

Организмы и клетки, как правило, весьма устойчивы даже к значительным изменениям рН окружающей среды. Внутриклеточные процессы, наоборот, обладают высокой чувствительностью к рН и протекают в среде, рН которой строго регулируется (правда, некоторые колебания рН могут наблюдаться и внутри клетки, например у поверхности мембраны). Большинство внутриклеточных процессов протекает при нейтральных значениях рН, когда их скорость максимальна. Гидролазы лизосом, однако, обладают максимальной активностью при рН 5,0. Желудочный сок млекопитающих имеет весьма необычную величину рН -- около 1; именно при этом рН активность фермента пепсина, начинающего переваривание белков пищи в желудке, максимальна.

В биологических системах постоянная величина рН поддерживается с помощью эффективных буферных систем, которые по своей химической природе таковы, что они препятствуют изменениям рН, возникающим в ходе метаболического образования кислот (например, молочной кислоты) и оснований (например, аммиака). Большинство буферных систем, содержащихся в клеточных жидкостях, включают фосфаты, бикарбонат, аминокислоты и белки.

Чувствительность биологических процессов к рН обусловлена целым рядом причин. Ионы водорода могут выступать в качестве катализатора ряда процессов, быть реагентом или продуктом реакции. Кроме того, при изменении рН может измениться проницаемость клеточной мембраны, а следовательно, и распределение веществ или ионов по обе ее стороны. Подобно другим биологическим структурам, мембраны содержат способные к ионизации группы, и в зависимости от степени их ионизации меняется конформация, а значит и биологическая активность молекул, в которые эти группы входят. Это прежде всего касается белков, а следовательно, ферментов. В некоторых белках небольшое изменение рН окружающей среды вызывает проявление биологической активности. На примере гемоглобина, основной функцией которого является перенос кислорода от легких к тканям, можно видеть, что при активном тканевом дыхании незначительное понижение рН в тканях в результате образования углекислоты и ионов водорода облегчает высвобождение кислорода. Процесс высвобождения кислорода сопровождается связыванием протонов гемоглобином, что увеличивает буферную емкость системы.

При изучении метаболических процессов in vitro возникает необходимость в применении «нефизиологических» буферных растворов: направленное изменение рН может значительно облегчить изучение таких типов молекул, как аминокислоты, белки и нуклеиновые кислоты с помощью электрофореза и ионообменной хроматографии.

1.2 Буферные растворы для биологических исследований

Буферным называется такой раствор, который препятствует изменению концентрации ионов водорода при добавлении к нему кислоты или щелочи. Такое действие раствора называется буферным. Величину буферного действия характеризуют буферной емкостью р, равной количеству сильного основания, которое необходимо добавить для изменения рН раствора на одну единицу.

где d(pH) -- изменение рН раствора при добавлении основания.

Обычно пользуются буферными растворами, состоящими из смеси слабой кислоты или основания и соли этой кислоты, например смеси уксусной кислоты и ацетата натрия (по номенклатуре Брёнстеда и Лоури буферный раствор представляет собой смесь слабой кислоты и сопряженного с ней основания).

При добавлении к раствору слабой кислоты (НА) и ее соли (А~) ионов водорода последние нейтрализуются анионами соли, которые действуют в данном случае как слабое основание; гидроксильные ионы, наоборот, нейтрализуются кислотой. Отсюда следует, что буферная емкость раствора, составленного из данной кислоты и сопряженного с ней основания, максимальна в том случае, когда их концентрации равны, т. е. рН = рКа кислоты. Буферная емкость зависит также от общей концентрации раствора и отношения соль-- кислота: чем выше концентрация раствора, тем больше его буферная емкость. Концентрация кислоты и соли в буферных растворах обычно бывает порядка 0,05--0,20 М, а достаточной буферной емкостью растворы обладают в области значений

рН = рКа ± 1

Буферы, применяемые для биологических исследований, должны удовлетворять ряду требований:

1. Обладать достаточной буферной емкостью в требуемом диапазоне значений рН.

2. Обладать высокой степенью чистоты.

3. Хорошо растворяться в воде и не проникать через биологические мембраны.

4. Обладать устойчивостью к действию ферментов и гидролизу.

5. рН буферных растворов должен как можно меньше зависеть от их концентрации, температуры и ионного или солевого состава среды.

6. Не оказывать токсического или ингибирующего действия.

7. Комплексы буфера с катионами должны быть растворимыми.

8. Не поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра.

К сожалению, этим требованиям удовлетворяют далеко не все буферные растворы. Так, фосфаты обладают способностью осаждать поливалентные катионы и во многих системах выступают в качестве метаболитов или ингибиторов; трис-буфер иногда оказывает токсическое или ингибирующее действие. До недавнего времени насчитывалось всего несколько буферов, рН которых лежит в важной для биохимии области 6,0--8,0 и которые удовлетворяют перечисленным выше требованиям. В последние годы, однако, появился целый ряд так называемых цвиттерионных буферов типа ГЭПЭС и ПИГТЭС. Некоторые наиболее распространенные буферы приведены в табл. 1.1. Для получения буферных растворов, применимых в широком диапазоне значений рН, используются смеси разных буферов. Например, буферы Мак-Ильвейна имеют рН с областью значений от 2,2 до 8,0 и приготавливаются из лимонной кислоты и двузамещенного фосфорнокислого натрия.

Наиболее важной группой физиологических буферов являются белки. Благодаря большому количеству содержащихся в боковых цепях аминокислот щелочных и слабокислых групп белки имеют очень высокую буферную емкость. Буферная емкость крови в основном определяется гемоглобином.

1.3 Зависимость ионизации аминокислот и белков от рН

Аминокислоты и белки -- это наиболее важные в биологическом отношении соединения, поэтому необходимо знать, в какой степени изменение рН влияет на их физические свойства. За исключением пролина, химические формулы всех аминокислот, из которых синтезируются белки, можно записать в общем ' виде как RCH(NH2)COOH. рН аминогруппы лежит в области 9,0--10,5, а карбоксильной группы -- между 1,7 и 2,4.

Степень ионизации аминокислот в водных растворах зависит от рН и определяется уравнением Гендерсона--Хассельбальха.

Таким образом, при низких значениях рН аминокислота находится в катионной форме, а при высоких -- в анионной. При некотором промежуточном значении рН аминокислота оказывается незаряженной и называется цвиттерионом. Было установлено, что в кристаллическом состоянии или после растворения в чистой воде такие аминокислоты существуют главным образом в виде цвиттерионов, что придает им свойства ионных соединений, а именно высокую точку плавления и кипения, хорошую растворимость в воде и плохую растворимость в таких органических растворителях, как эфир и хлороформ. Величина рН, при которой в водном растворе преобладает цвиттерион, называется изоионной точкой: число отрицательных зарядов, образующихся на молекуле в результате отщепления протонов, равно числу положительных зарядов, образующихся благодаря присоединению протонов. Для аминокислот эта величина приблизительно соответствует изоэлектрической точке (pi) -- молекула не несет суммарного заряда и таким образом оказывается электрофоретически неподвижной. Численное значение рН для этого случая зависит от того, насколько сильной является кислота, и определяется следующим уравнением:

Для глицина величины рКа, Н рКаг равны 2, 3 и 9,6 соответственно; следовательно, изоионная точка равна 6,0. При более низких значениях рН в растворе содержатся и цвиттерион, и катион, а соотношение между ними определяется уравнением Гендерсона -- Хассельбальха; при более высоких рН наряду с цвиттерионом в растворе находится анион.

Для так называемых «кислых» аминокислот, например, аспарагиновой кислоты; ионизация носит несколько иной характер. Это обусловлено наличием у них второй карбоксильной группы.

В этом случае рН, при котором в водном растворе преобладает цвиттерион, определяется величинами рСа, и рКаз

Для лизина, который является «основной» аминокислотой, изоионная точка определяется величинами рКа2 и рКа3- Ионизация происходит следующим образом:

Вместо второй амино- или карбоксильной группы боковая цепь аминокислоты иногда содержит другую химическую группу, которая при определенном значении рН также ионизуется. К таким группам относятся фенольная (тирозин), гуанидиновая (аргинин), имидазольная (гистидин) и сульфгидрильная группа (цистеин). Ясно, что степень ионизации различных основных групп аминокислот при одном и том же рН будет различной. Более того, небольшие различия могут наблюдаться даже у одной и той же группы. Эти различия используют при электрофоретическом и ионообменном разделении смесей аминокислот, имеющихся, например, в белковом гидролизате.

Ионизация молекул белка качественно напоминает ионизацию аминокислот, но в количественном отношении отличается от нее благодаря наличию большого числа способных к ионизации групп. Белки образуются путем конденсации а-аминогруппы одной аминокислоты с о-карбоксильной группой соседней аминокислоты, поэтому, за исключением двух концевых аминокислот, все о амино- и карбоксильные группы участвуют в образовании пептидных связей и в белке не ионизуются. Однако в боковых цепях присутствуют сотни амино- и карбоксильных групп, которые могут легко ионизоваться. Электростатическое притяжение, возникающее между некоторыми из этих групп, способствует стабилизации третичной структуры белковой молекулы, при этом молекулы белков часто бывают свернуты таким образом, что большинство способных к ионизации групп оказываются расположенными на поверхности молекулы, где они могут вступать во взаимодействие с окружающей средой. Естественно, что относительное число положительно и отрицательно заряженных групп в молекуле белка определяет те или иные ее физические свойства. У гистонов преобладают катионные группы, в то время как в других белках количество анионных и катионных групп либо одинаково, либо, напротив, преобладают анионные группы.

В отличие от аминокислот у белков изоионная точка обычно не совпадает с изоэлектрической. По определению изоионная точка -- это такая величина рН, при которой молекула белка содержит равное число положительно и отрицательно заряженных групп, образовавшихся в результате связывания основных групп с протонами и соответствующей диссоциации кислотных групп. Изоэлектрическая точка -- это рН, при котором белок электрофоретически неподвижен. При ее определении белок растворяют в буферном растворе. В этом растворе всегда содержатся низкомолекулярные анионы и катионы, способные связываться с многочисленными заряженными группами белка. В таких условиях наблюдаемое в изоэлектрической точке равновесие зарядов частично обусловлено их компенсацией связавшимися с молекулой белка анионами и катионами.

Молекулы белка всегда изучают в буферных растворах; при этом важно установить изоэлектрическую точку, поскольку, на пример, именно при этом значении рН создаются наиболее благоприятные условия для взаимодействия между противоположно заряженными группами соседних молекул, что ведет к их последующей агрегации и быстрому осаждению.

Агрегацию, а следовательно, и осаждение белковых молекул можно вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок -- белок начинают преобладать над взаимодействиями белок -- вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза.

2. Подходы к биохимическому исследованию

Как мы уже говорили, активность клетки зависит от взаимодействия ее как с непосредственным окружением, так и с клетками, значительно удаленными от нее; кроме того, играет роль также и то, какие методы применяются для ее изучения. Поэтому чтобы получить наиболее полное представление о состоянии клеток внутри органов и тканей, опыты лучше всего проводить на интактных изолированных органах и тканях. Преимущество такого изучения заключается в том, что при этом удается избежать нежелательных эффектов, обусловленных изменением непосредственного тканевого окружения, как это имеет место, например, при фракционировании клеток. Исследование на уровне целых организмов не только не нарушает целостности тканей, но позволяет изучать отдельные органы и ткани, оставляя без изменения снабжение их питательными веществами, нервную и гормональную регуляцию и т. д. Таким образом, чтобы получить полную картину клеточного обмена, необходимо провести исследование на целом организме, изолированном органе, на уровне клетки, клеточной органеллы, на молекулярном и атомном уровнях.

На рис. 1.1 показаны пути биохимических подходов к изучению возможных превращений какого-либо экзогенного соединения (ксенобиотика) в организме животного или его действия на этот организм. Существуют два подхода, которые взаимно дополняют друг друга.

Первый из них заключается в том, что животному вводят соединение, а затем выделяют и идентифицируют все продукты, выводимые из организма. В других случаях спустя некоторое время после введения соединения животное умерщвляют, выделяют и фракционируют нужный орган или ткань, а затем изучают судьбу введенного соединения или исследуют его действие на интересующую субклеточную систему.

Второй подход состоит во введении соединения на одном из указанных на рис. 1.1 уровнях (т. е. в соответствующий изолированный орган, гомогенат, органеллу или субклеточную систему) и изучении действия этого соединения или путей его превращения на данном или более низких уровнях.

Действие какого-либо соединения можно исследовать на нескольких клеточных частицах или органеллах, каждую из которых необходимо для этого выделить из системы и подвергнуть анализу.

Зачастую исследуемое соединение представляет собой природный метаболит или входит в состав самого организма, а иногда является изотопом составного компонента организма. С другой стороны, не всегда действие какого-либо экзогенного соединения на функционирование организма представляет интерес для биохимика. В любом случае изучение можно проводить на любом из вышеуказанных уровней организации, а получаемые на каждом уровне результаты помогают составить более полное представление о процессах, протекающих в организме.

3. Исследования на уровне целого организма

Биохимические эксперименты на животных могут быть предприняты с различными целями. Применяя в течение длительного времени специальную диету, лишенную определенных витаминов или микроэлементов, и одновременно регистрируя возникающие при этом физиологические и клинические изменения, можно исследовать метаболическую роль данного витамина или микроэлемента. Вместе с тем, вводя животному какое-либо экзогенное соединение, можно изучать как влияние этого соединения на организм животного (фармакологическая или патологическая ответная реакция), так и влияние организма на введенное соединение, т. е. его превращения и выведение. В последнее время, главным образом благодаря созданию комитета Данлопа (ныне Комитет по безопасности применения лекарственных средств) после известной трагедии с талидомидом, все большее внимание стали уделять вопросам о том, каким образом различные лекарственные вещества, пищевые добавки и красители, а также такие соединения, как ДДТ, накапливаются в пище и метаболизируются, где они локализуются, какое разрушающее действие оказывают на органы и ткани и какие тератогенные и канцерогенные побочные эффекты могут вызывать.

Единственным способом исследовать пути превращения введенных соединений у человека является определение содержания этих соединений и их метаболитов в крови, моче, фекалиях, желчи, выдыхаемом воздухе, поте и слюне. О поражении органа судят по изменению содержания в сыворотке крови таких ферментов, как аспартат--аминотрансфераза и лактатдегидрогеназа. После введения соединений лабораторных животных умерщвляют, а затем исследуют изолированные органы.

Результаты, получаемые при анализе содержания каких-либо соединений и их метаболитов в биологических жидкостях и экскрементах живых организмов, в том числе и организма человека, зависят от многих взаимосвязанных факторов. К этим факторам относятся:

Способ введения соединения (перорально или путем внутривенной, внутримышечной, подкожной или внутрибрюшинной инъекции).

Скорость всасывания соединения в кровоток; если соединение вводят не внутривенно, то оно должно проникнуть (обычно путем пассивной диффузии) по крайней мере через одну мембрану (если соединение представляет собой слабый электролит, то оно должно пройти через мембрану в неионизованной форме).

Степень связывания соединения с сывороточным альбумином.

Кровоснабжение тканей.

Способность данного соединения проходить через мембраны и распределяться в межклеточных и внутриклеточных жидкостях.

Накопление соединения в жировой ткани и характер его связывания с нуклеиновыми кислотами и меланином.

Скорость метаболизма соединения (главным образом ферментной системой микросом печени).

Скорость выведения (с мочой и желчью).

Совокупность вышеперечисленных факторов создает характер.

Для данного соединения «фармако-кинетическую» картину. Помимо всего перечисленного, имеют значение также возраст, пол, режим питания, физические нагрузки, генетическое строение животного, а также время дня, когда животному было введено соединение (ввиду наличия у животных циркадного ритма). Оказалось даже, что превращение введенного соединения у животных, содержащихся в клетках с мягкими опилками, происходит быстрее, чем у животных, помещенных в клетки с жесткими опилками. Именно благодаря огромному многообразию переменных эксперименты всегда следует проводить не на одном животном, а на целых группах. Исследования нужно проводить на животных чистых линий, а получаемые экспериментальные данные подвергать тщательной статистической обработке. Результаты анализа фармакологического действия введенных экспериментальным животным соединений необходимо сопоставлять с данными, получаемыми в группе контрольных животных, которым было введено плацебо, т. е. совершенно нейтральное вещество, например лактоза.

Изучение метаболизма ксенобиотиков проводят на самых разных > лабораторных животных -- мышах, крысах, морских свинках (из-за их малой стоимости и простоты ухода за ними); наряду с ними для опытов используют также кроликов, кошек, собак и обезьян. Одной из основных проблем, стоящих перед биохимиками и фармакологами, является экстраполяция результатов, полученных на лабораторных животных, к человеку. Многочисленные сравнительные исследования показали, что метаболические процессы у человека и всех исследованных видов животных существенно различаются. Именно по этой причине новые лекарственные препараты, предназначенные для введения человеку, предварительно проходят испытание не на одном животном, а на целом ряде различных лабораторных животных. Только после тщательного сравнительного анализа полученных результатов клинические испытания можно проводить на человеке.

При изучении метаболизма ксенобиотиков удобнее всего вводить их в виде изотопных меток; как правило, вводят препараты, меченные по 14 0С. Экскрецию у мелких лабораторных животных целесообразно изучать с помощью специальной метаболической стеклянной камеры, в которую животное помещают на все время опыта (рис. 1.2). Благодаря особой конструкции камеры моча и фекалии собираются отдельно, а выдыхаемый углекислый газ поступает в специальную ловушку. При изучении меченных по углероду соединений в клетку подается воздух, не содержащий углекислого газа, а выдыхаемый углекислый газ поглощается раствором гидроокиси натрия; анализ выдыхаемого углекислого газа, меченного по углероду (14С02), позволяет установить степень распада изучаемого соединения. Выделяемые с мочой и фекалиями вещества и их метаболиты связаны, как правило, с такими соединениями, как Р-глюкуроновая кислота, глицин, глутатион и сульфат, что повышает растворимость метаболитов в воде, а следовательно, и степень их экскреции. Поэтому перед экстракцией метаболитов органическими растворителями (эфиром или хлороформом) пробы экскрементов нужно гидролизовать, предварительно исследовав их соответствующими аналитическими методами.

Страницы: 1, 2