Химия наследственности. Нуклеиновые кислоты. ДНК. РНК. Репликация ДНК и передача наследственной информации

В каждой цепи нуклеотиды соединяются путем образования ковалентных связей

между дезоксирибозой одного и остатком фосфорной кислоты последующего

нуклеотида. Объединяются две цепи в одну молекулу при помощи водородных

связей, возникающих между азотистыми основаниями, входящими в состав

нуклеотидов, образующих разные цепи.

Исследуя нуклеотидный состав ДНК различного происхождения, Чаргафф

обнаружил следующие закономерности.

1. Все ДНК независимо от их происхождения содержат одинаковое число

пуриновых и пиримидиновых оснований. Следовательно, в любой ДНК на каждый

пуриновый нуклеотид приходится один пиримидиновый.

2. Любая ДНК всегда содержит в равных количествах попарно аденин и

тимин, гуанин и цитозин, что обычно обозначают как А=Т и G=C. Из этих

закономерностей вытекает третья.

3. Количество оснований, содержащих аминогруппы в положении 4

пиримидинового ядра и 6 пуринового (цитозин и аденин), равно количеству

оснований, содержащих оксо-группу в тех же положениях (гуанин и тимин), т.

е. A+C=G+T. Эти закономерности получили название правил Чаргаффа. Наряду с

этим было установлено, что для каждого типа ДНК суммарное содержание

гуанина и цитозина не равно суммарному содержанию аденина и тимина, т. е.

что (G+C)/(A+T), как правило, отличается от единицы (может быть как больше,

так и меньше ее). По этому признаку различают два основных типа ДНК: А(Т-

тип с преимущественным содержанием аденина и тимина и G(C-тип с

преимущественным содержанием гуанина и цитозина.

Величину отношения содержания суммы гуанина и цитозина к сумме

содержания аденина и тимина, характеризующую нуклеотидный состав данного

вида ДНК, принято называть коэффициентом специфичности. Каждая ДНК имеет

характерный коэффициент специфичности, который может изменяться в пределах

от 0,3 до 2,8. При подсчете коэффициента специфичности учитывается

содержание минорных оснований, а также замены основных оснований их

производными. Например, при подсчете коэффициента специфичности для ЭДНК

зародышей пшеницы, в которой содержится 6% 5-метилцитозина, последний

входит в сумму содержания гуанина (22,7%) и цитозина (16,8%). Смысл правил

Чаргаффа для ДНК стал понятным после установления ее пространственной

структуры.

4.2. Макромолекулярная структура ДНК

В 1953 г. Уотсон и Крик, опираясь на известные данные о конформаци

нуклеозидных остатков, о характере межнуклеотидной связи в ДНК и

закономерности нуклеотидного состава ДНК (правила Чаргаффа), расшифровали

рентгенограммы паракристаллической формы ДНК [так называемой В-формы,

образующейся при влажности выше 80% и при высокой концентрации противоионов

(Li+) в образце]. Согласно их модели, молекула ДНК представляет собой

правильную спираль, образованную двумя полидезоксирибонуклеотидными цепями,

закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Диаметр спирали

практически постоянен вдоль всей ее длины и равен 1,8 нм (18 А).

[pic]

Макромолекулярная структура ДНК.

(а)—Модель Уотсона — Крика;

(6)—параметры спиралей В-, С- и Т-форм ДНК (проекции

перпендикулярно оси спирали);

(в)—поперечный разрез спирали ДНК в В-форме (заштрихованные

прямоугольники изображают пары оснований);

(г)—параметры спирали ДНК в А-форме;

(д)—поперечный разрез спирали ДНК в А-форме.

Длина витка спирали, который соответствует ее периоду идентичности,

составляет 3,37 нм (33,7 А). На один виток спирали приходится 10 остатков

оснований в одной цепи. Расстояние между плоскостями оснований равно, таким

образом, примерно 0,34 нм (3,4 А). Плоскости остатков оснований

перпендикулярны длинной оси спирали. Плоскости углеводных остатков

несколько отклоняются от этой оси (первоначально Уотсон и .Крик

предположили, что они параллельны ей).

Из рисунка видно, что углеводофосфатный остов молекулы обращен наружу.

Спираль закручена таким образом, что на ее поверхности можно выделить две

различные по размерам бороздки (их часто называют также желобками) —

большую, шириной примерно 2,2 нм (22 А), и малую —шириной около 1,2 нм

(12А). Спираль — правовращающая. Полидезоксирибонуклеотидные цепи в ней

антипараллельны: это означает, что если мы будем двигаться вдоль длинной

оси спирали от одного ее конца к другому, то в одной цепи мы будем

проходить фосфодиэфирные связи в направлении 3'(5', а в другой — в

направлении 5'(3'. Иными словами, на каждом из концов линейной молекулы ДНК

расположены 5'-конец одной и 3'-конец другой цепи.

Регулярность спирали требует, чтобы против остатка пуринового

основания в одной цепи находился остаток пиримидинового основания в другой

цепи. Как уже подчеркивалось, это требование реализуется в виде принципа

образования комплементарных пар оснований, т. е. остаткам аденина и гуанина

в одной цепи соответствуют остатки тимина и цитозина в другой цепи (и

наоборот).

Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепи молекулы

ДНК предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи.

Этот принцип является главным следствием модели Уотсона и Крика,

поскольку он в удивительно простых химических терминах объясняет основное

функциональное назначение ДНК — быть хранителем генетической информации.

Заканчивая рассмотрение модели Уотсона и Крика, остается добавить, что

соседние пары остатков оснований в ДНК, находящейся в В-форме, повернуты

друг относительно друга на 36° (угол между прямыми, соединяющими атомы С1'

в соседних комплементарных парах).

4.3. Выделение дезоксирибонуклеиновых кислот

Живые клетки, за исключением сперматозоидов, в норме содержат

значительно больше рибонуклеиновой, чем дезоксирибонуклеиновой кислоты. На

методы выделения дезоксирибонуклеиновых кислот оказало большое влияние то

обстоятельство, что, тогда как рибонуклеопротеиды и рибонуклеиновые кислоты

растворимы в разбавленном (0,15 М) растворе хлористого натрия,

дезоксирибонуклеопротеидные комплексы фактически в нем нерастворимы.

Поэтому гомогенизированный орган или организм тщательно промывают

разбавленным солевым раствором, из остатка с помощью крепкого солевого

раствора экстрагируют дезоксирибонуклеиновую кислоту, которую осаждают

затем добавлением этанола. С другой стороны, элюирование того же остатка

водой дает раствор, из которого при добавлении соли выпадает

дезоксирибонуклеопротеид. Расщепление нуклеопротеида, который в основном

представляет собой солеподобный комплекс между полиосновными и

поликислотными электролитами, легко достигается растворением в крепком

солевом растворе или обработкой тиоцианатом калия. Большую часть белка

можно удалить либо добавлением этанола, либо эмульгированием с помощью

хлороформа и амилового спирта (белок образует с хлороформом гель). Широко

применялась также обработка детергентами. Позднее дезоксирибонуклеиновые

кислоты выделяли с помощью экстракции водными n-аминосалицилат — фенольными

растворами. При использовании этого метода были получены препараты

дезоксирибонуклеиновой кислоты, из которых одни содержали остаточный белок,

тогда как другие были фактически свободны от белка, что указывает на то,

что характер связи белок — нуклеиновая кислота различен в различных тканях.

Удобная модификация состоит в гомогенизировании животной ткани в 0,15 М

растворе фенолфталеиндифосфата с последующим добавлением фенола для

осаждения ДНК (свободной от РНК) с хорошим выходом.

Дезоксирибонуклеиновые кислоты, каким бы способом они не выделялись,

представляют собой смеси полимеров различного молекулярного веса, за

исключением образцов, полученных из некоторых видов бактериофагов.

4.4. Фракционирование

Ранний метод разделения заключался в фракционной диссоциации гелей

дезоксирибонуклеопротеида (например, нуклеогистона) посредством экстракции

водными растворами хлористого натрия увеличивающейся молярности. Таким

путем препараты дезоксирибонуклеиновой кислоты были разделены на ряд

фракций, характеризующихся различным отношением содержания аденина с

тимином к сумме гуанина с цитозином, причем более легко выделялись фракции,

обогащенные гуанином и цитозином. Сходные результаты были получены при

хроматографическом отделении дезоксирибонуклеиновой кислоты от гистона,

адсорбированного на кизельгуре, с применением градиентного элюирования

растворами хлористого натрия. В улучшенном варианте этого метода очищенные

фракции гистона сочетались с n-аминобензилцеллюлозой с образованием

диазомостиков от тирозиновых и гистидиновых групп белка. Описано также

фракционирование нуклеиновых кислот на метилированном сывороточном

альбумине (с кизельгуром в качестве носителя). Скорость элюирования с

колонки солевыми растворами увеличивающейся концентрации зависит от

молекулярного веса, состава (нуклеиновые кислоты с высоким содержанием

гуанина с цитозином элюируются легче) и вторичной структуры

(денатурированная ДНК прочнее удерживается колонкой, чем нативная). Таким

способом из ДНК морского краба Cancer borealis выделен природный компонент

— полидезоксиадениловая-тимидиловая кислота. Фракционирование

дезоксирибонуклеиновых кислот проводилось также посредством градиентного

элюирования с колонки, наполненной фосфатом кальция.

4.5. Функции ДНК

В молекуле ДНК с помощью биологического кода зашифрована

последовательность аминокислот в пептидах. Каждая аминокислота кодируется

сочетанием трех нуклеотидов, в этом случае образуется 64 триплета, из

которых 61 кодируют аминокислоты, а 3 являются бессмысленными и выполняют

функцию знаков препинания (АТТ, АЦТ, АТЦ). Шифрование одной аминокислоты

несколькими триплетами получило название как вырожденность триплетного

кода. Важными свойствами генетического кода является его специфичность

(каждый триплет способен кодировать только одну аминокислоту),

универсальность (свидетельствует о единстве происхождения всего живого на

Земле) и неперекрываемость кодонов при считывании.

ДНК выполняет следующие функции:

V хранение наследственной информации происходит с помощью гистонов.

Молекула ДНК сворачивается, образуя вначале нуклеосому, а после

гетерохроматин, из которого состоят хромосомы;

V передача наследственного материала происходит путем репликации ДНК;

V реализация наследственной информации в процессе синтеза белка.

5. РНК

5.1. Состав РНК

Первые сведения о нуклеотидном составе РНК относились к препаратам,

представляющим собой смеси клеточных РНК (рибосомных, информационных и

транспортных) и называемым обычно суммарной фракцией РНК. Правила Чаргаффа

в этом случае не соблюдаются, хотя определенное соответствие между

содержанием гуанина и цитозина, а также аденина и урацила все же имеет

место.

Данные, полученные в последние годы при анализе индивидуальных РНК,

показывают, что и на них правила Чаргаффа не распространяются. Однако

различия в содержании аденина и урацила, а также гуанина и цитозина для

большинства РНК невелики и что, следовательно, тенденция к выполнению

указанных правил все же наблюдается. Этот факт объясняется особенностями

макроструктуры РНК.

Характерными структурными элементами некоторых РНК являются минорные

основания. Соответствующие им нуклеотидные остатки обычно входят в состав

транспортных и некоторых других РНК в очень небольших количествах, поэтому

определение полного нуклеотидного состава таких РНК представляет собой

иногда весьма сложную задачу.

5.2. Макромолекулярная структура РНК

Химически РНК очень похожа на ДНК. Оба вещества - это линейные

полимеры нуклеотидов. Каждый мономер - нуклеотид - представляет собой

фосфорилированный N-гликозид, построенный из остатка пятиуглеродного сахара

- пентозы, несущего фосфатную группу на гидроксильной группе пятого

углеродного атома (сложноэфирная связь) и азотистое основание при первом

углеродном атоме (N-гликозидная связь). Главное химическое различие между

ДНК и РНК состоит в том, что сахарный остаток мономера РНК - это рибоза, а

мономера ДНК - дезоксирибоза, являющаяся производным рибозы, в котором

отсутствует гидроксильная группа при втором углеродном атоме (рис. 4).

[pic]

Рис.4. Химические формулы остатков одного из рибонуклеотидов – уридиловой

кислоты (U) и гомологичного ему

дезоксирибонуклеотида тимидиловой кислоты (dT)

Азотистых оснований в РНК четыре вида: два пуриновых - аденин (А) и

гуанин (G) -и два пиримидиновых - цитозин (С) и урацил (U)

Мономеры - рибонуклеотиды РНК - образуют полимерную цепь посредством

формирования фосфодиэфирных мостиков между сахарными остатками (между пятым

и третьим атомами углерода пентозы). Таким образом, полимерная цепь РНК

может быть представлена как линейный сахаро-фосфатный остов с азотистыми

основаниями в качестве боковых групп.

Впервые специфическая пространственная структура РНК была

продемонстрирована при расшифровке атомной структуры одной из т-РНК в 1974

г. (рис. 5). Сворачивание полимерной цепи тРНК, состоящей из 76

нуклеотидных мономеров, приводит к формированию очень компактного

глобулярного ядра, из которого под прямым углом торчат два выступа. Они

представляют собой короткие двойные спирали по типу ДНК, но организованные

за счет взаимодействия участков одной и той же цепи РНК. Один из выступов

является акцептором аминокислоты и участвует в синтезе полипептидной цепи

белка на рибосоме, а другой предназначен для комплементарного

взаимодействия с кодирующим триплетом (кодоном) м-РНК в той же

рибосоме. Только такая структура способна специфически взаимодействовать с

белком-ферментом, навешивающим аминокислоту на т-РНК, и с рибосомой в

процессе трансляции, то есть специфически "узнаваться" ими.

[pic]

Рис. 5. Атомная (слева) и скелетная (справа) модели фенилаланиновой т-

РНК дрожжей

Изучение изолированных рибосомных РНК дало следующий разительный

пример формирования компактных специфических структур из еще более длинных

линейных полимеров этого типа. Рибосома состоит из двух неравных частей -

большой и малой рибосомных субчастиц (субъединиц). Каждая субчастица

построена из одной высокополимерной РНК и целого ряда разнообразных

рибосомных белков. Длина цепей рибосомных РНК весьма значительна: так, РНК

малой субчастицы бактериальной рибосомы содержит более 1500 нуклеотидов, а

РНК большой субчастицы - около 3000 нуклеотидов. У млекопитающих, включая

человека, эти РНК еще больше - около 1900 нуклеотидов и более 5000

нуклеотидов в малой и большой субчастицах соответственно.

5.3. Мультифункциональность РНК

Суммирование и обзор знаний о функциях РНК позволяют говорить о

необыкновенной многофункциональности этого полимера в живой природе. Можно

дать следующий список основных известных функций РНК.

• Генетическая репликативная функция: структурная возможность

копирования (репликации) линейных последовательностей нуклеотидов через

комплементарные последовательности. Функция реализуется при вирусных

инфекциях и аналогична главной функции ДНК в жизнедеятельности клеточных

организмов - редупликации генетического материала.

• Кодирующая функция: программирование белкового синтеза линейными

последовательностями нуклеотидов. Это та же функция, что и у ДНК. И в ДНК,

и в РНК одни и те же триплеты нуклеотидов кодируют 20 аминокислот белков, и

последовательность триплетов в цепи нуклеиновой кислоты есть программа для

последовательной расстановки 20 видов аминокислот в полипептидной цепи

белка.

• Структурообразующая функция: формирование уникальных трехмерных

структур. Компактно свернутые молекулы малых РНК принципиально подобны

трехмерным структурам глобулярных белков, а более длинные молекулы РНК

могут образовывать и более крупные биологические частицы или их ядра.

• Функция узнавания: высокоспецифические пространственные

взаимодействия с другими макромолекулами (в том числе белками и другими

РНК) и с малыми лигандами. Эта функция, пожалуй, главная у белков. Она

основана на способности полимера сворачиваться уникальным образом и

формировать специфические трехмерные структуры. Функция узнавания является

базой специфического катализа.

• Каталитическая функция: специфический катализ химических реакций

рибозимами. Данная функция аналогична энзиматической функции белков-

ферментов.

В целом РНК предстает перед нами столь удивительным полимером, что,

казалось бы, ни времени эволюции Вселенной, ни интеллекта Творца не должно

было бы хватить на ее изобретение. Как можно было видеть, РНК способна

выполнять функции обоих принципиально важных для жизни полимеров - ДНК и

белков. Неудивительно, что перед наукой и встал вопрос: а не могло ли

возникновение и самодостаточное существование мира РНК предшествовать

появлению жизни в ее современной ДНК-белковой форме?

5.4. Выделение рибонуклеиновых кислот

Методы, используемые для экстракции рибонуклеиновых кислот, частично

зависят от природы органа или организма. В одном из ранних методов,

использованном Левиным, к густому тесту из дрожжей добавляли щелочь, смесь

перемешивали с пикриновой кислотой, фильтровали и нуклеиновую кислоту

осаждали из фильтрата добавлением соляной кислоты. Такая довольно жесткая

обработка приводила к тому, что полученная нуклеиновая кислота значительно

отличалась от «нативной» рибонуклеиновой кислоты. Для выделения

рибонуклеиновых кислот, приближающихся по структуре к нуклеиновым кислотам

живой клетки, необходимо избегать применения жестких условий (рН,

температура) в то же время необходимо, насколько возможно, затормозить

ферментативный распад. Широко применялась экстракция рибонуклеопротеидов

изотоническим раствором хлористого натрия. Белки от нуклеиновых кислот

могут быть отщеплены различными методами, такими, как обработка смесями

хлороформа с октиловым спиртом, додецилсульфатом натрия, нитратом стронция

или спиртом, а также расщепление белковой фракции трипсином. И снова

эффективность каждого метода определяется природой рибонуклеопротеида. Для

инактивации ферментов в процессе экстракции полезно применение хлоргидрата

гуанидина (денатурирующего агента); для выделения рибонуклеиновых кислот и

нативных рибонуклеопротеидов из дрожжей был применен метод, использующий

адсорбцию рибонуклеаз на бентоните после предварительной обработки ионами

цинка.

Особые преимущества имеет выделение рибонуклеиновых кислот из

гомогенатов тканей млекопитающих, микроорганизмов и вирусов экстракцией

фенолом и водой при комнатной температуре, так как при этом белки и

дезоксирибонуклеиновые кислоты выпадают в осадок, активность рибонуклеазы

подавляется и высокополимерные продукты могут быть получены с хорошими

выходами. Прямая экстракция дрожжей водным раствором фенола была применена

для препаративного получения транспортных РНК.

5.5. Фракционирование

Помимо ряда вирусных нуклеиновых кислот, большинство выделенных

полирибонуклеотидов, бесспорно, представляют собой сложные смеси,

содержащие полимеры с различной длиной цепи, нуклеотидной

последовательностью и составом оснований (присутствие или отсутствие

«минорных» оснований). Существует ряд приемов для частичного

фракционирования, однако, пока не разработаны удовлетворительные методы

характеристики, трудно определить степень чистоты или гомогенности

рибонуклеиновых кислот. В основу оценки чистоты транспортных РНК, этих

сравнительно низкомолекулярных полирибонуклеотидов, может быть положена их

ферментативная реакция с аминокислотами (через аминоациладенилаты), что,

конечно, позволяет оценить и их биохимическую однородность.

Методы фракционирования включают осаждение нейтральными солями,

электрофорез, хроматографию на фосфате кальция и осаждение

днгидрострептомицином. Недавно для фракционирования рибонуклеиновых кислот

была использована фракционная диссоциация комплексов нуклеиновая кислота —

гистон, примененная ранее к дезоксинуклеиновым кислотам. Во всех фракциях

отношение 6-амино- к 6-кетонуклеозидам было близко к единице. В некоторой

степени фракционирование происходит при экстракции фенолом, возможно как

результат дифференциального связывания нуклеиновых кислот с белками.

Анионообменные целлюлозы, такие как ЭКТЕОЛА и ДЭАЭ, широко применяются в

настоящее время для фракционирования не только рибонуклеиновых кислот,

включая специфичные для аминокислот транспортные РНК, но и

рибонуклеопротеидов и даже вирусных препаратов. Для элюирования обычно

используют растворы нейтральных или близких к нейтральным солеи.

Поразительной особенностью метода является способность этих ионообменников

к разделению очень широкого спектра веществ, начиная от изомеров

мононуклеотидов и олигонуклеотидов с различной длиной цепи или различного

состава и кончая полинуклеотидами чрезвычайно высокого молекулярного веса.

Опубликовано сообщение о разделении на колонках из ДЭАЭ-декстрана РНК,

меченной валином, от немеченой акцепторной РНК. Для фракционирования

рибонуклеиновых кислот были также применены модифицированные ионообменные

целлюлозы, в которых к целлюлозе с помощью эпихлоргидрина присоединены

Страницы: 1, 2, 3