ДНК. Основы генетического материал

ДНК. Основы генетического материал

Челябинский Государственный Университет

Юридический факультет

Контрольная работа

По предмету: «Концепции современного естествознания»

На тему: «ДНК. Основы генетического материал»

Выполнил:

студент гр. ЗЮ-

Проверил:

____________________

Челябинск 2009

Содержание

Введение

1. Общие понятия о дезоксирибонуклеиновых кислотах

2. Способы получения ДНК

3. Химический состав и физико-химические свойства ДНК

4. Методы количественного и качественного определения и исследования

5. Содержание в клетках и тканях

6. Биосинтез

7. Биологическая роль

8. Гистохимические методы обнаружения в тканях

Заключение

Литература

Введение

Нуклеиновые кислоты имеют первостепенное биологическое значение и представляют собой сложные высокомолекулярные биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды.

Они впервые были обнаружены в ядрах клеток, откуда и их название (нуклеус -- ядро).

Существует два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая.

Важные открытия были сделаны учеными, они открыли молекулу ДНК. На основе этой молекулы строится вся жизнь.

Немного из истории. ДНК впервые были открыты Мишером (F. Micscher, 1869), который назвал полученное вещество нуклеином (лат. nucleus ядро). Впоследствии было показано, что нуклеин представляет собой высокомолекулярную, содержащую фосфор кислоту, находящуюся в комплексе с белками, поэтому стали различать собственно нуклеиновую кислоту [Альтманн (R. Altmann), 1889] и ее комплексы с белками -- нуклеопротеиды. Вскоре нуклеиновая кислота была получена из вилочковой железы (тимуса) теленка, оказавшейся богатым источником итого вещества. Вещество, близкое но свойствам, но отличающееся от нуклеиновой кислоты, полученной из тимуса, выделили из дрожжей. Выяснилось, что нуклеиновая кислота из дрожжей содержит аденин, гуанин, цитозин и урацил, тогда как нуклеиновая кислота. выделенная из тимуса теленка, вместо урацила содержит тимин. В качестве углеводного компонента в дрожжевой нуклеиновой кислоте нашли пентозу, а в препарате из тимуса -- дезоксипентозу. В зависимости от источника получения эти нуклеиновые кислоты получили названия тимонуклеиновой и зимонуклеиновой. Поскольку первый тип нуклеиновой кислоты находили в животных объектах, а второй -- в растительных, употребляли также названия «животная» и «растительная» нуклеиновые кислоты. Однако, когда Фейльген (R. Feulgen) разработал гистохимическую реакцию на «животную» нуклеиновую кислоту, оказалось, что она обнаруживается в ядре как животных, так и растительных клетоколо С другой стороны, «дрожжевая» нуклеиновая кислота была найдена Ж. Браше главным образом в цитоплазме клеток и растений, и животных. Наконец, А. Н. Белозерским наличие ДНК у растений было доказано химически. Названия «дезоксирибонуклеиновая кислота» (ДНК) и «рибонуклеиновая кислота» (РНК) были предложены после того, как Левином (Р.A. Levenе) было установлено, что дезоксипентоза в тимонуклеиновой кислоте является дезоксирибозой, а пентоза в зимонуклеиновой кислоте -- рибозой.

1. Общие понятия о дезоксирибонуклеиновых кислотах

Дезоксирибонуклейновые кислоты (ДНК; устаревшие названия: дезоксипентозонуклеиновые кислоты, ядерные нуклеиновые кислоты, тимонукленновые кислоты, животные нуклеиновые кислоты) -- нуклеиновые кислоты, содержащие в качестве углеводного компонента дезоксприбозу, а в качестве одного из пиримидиновых оснований -- тимин, которым в молекулах рибонуклеиновых кислот соответствуют рибоза и урацил. ДНК представляют собой линейные полимеры дезоксирибонуклеотидов, в последовательности азотистых оснований которых закодирована вся наследственная информация.

Таким образом, ДНК данного организма содержит в себе информацию о всех признаках вида и особенностях индивидуума -- его генотип -- и передает эту информацию потомству, воспроизводя определенную последовательность оснований в строении индивидуальных ДНК. Поскольку молекулы ДНК очень больших размеров и существует огромное множество возможных неодинаковых последовательностей из четырех различных нуклеотидов, число разных молекул ДНК практически бесконечно.

В природе ДНК содержатся во всех организмах за исключением РНК-содержащих вирусов. ДНК являются типичным компонентом клеточного ядра, в котором они находятся в комплексе с белками, главным образом гистонами, образуя дезоксприбонуклеопротеиды, составляющие основу цитологической структуры хроматина и вещества хромосом. ДНК обнаружена также в хлоропластах растительной клетки и в митохондриях животных и растений, в которых она кодирует часть белков этих структур, благодаря чему они обладают некоторой автономией и лишь частично зависят от ДНК ядра.

2. Способы получения ДНК

Методика выделения ДНК зависит от состава и характера используемого источника (ткани животных или растений, микроорганизмы, вирусы). Для лабораторного и промышленного получения ДНК обычно используют вилочковую железу теленка, а также сперму (молоки) рыб, селезенку млекопитающих, ядерные эритроциты птиц.

Препараты ДНК, получаемые обычно в виде натриевой соли ДНК, имеют вид белых волокон. Для сохранения нативных свойств ДНК обработку тканей и клеток проводят на холоду, по возможности быстро, в условиях, исключающих или уменьшающих действие дезоксирибонуклеаз, как правило, содержащихся в тканях и вызывающих ферментативный распад ДНК. Помимо сохранения нативных свойств, важнейшей задачей является очистка ДНК от других веществ, в первую очередь -- от белков и РНК. В связи с этим методы получения ДНК различаются главным образом способами депротеинизации и очистки препаратов от примесей РНК. Для этих целей применяют обработку клеток и тканей различными детергентами, фенолами и другими депротеинизирующими агентами.

При получении ДНК из животных и растительных тканей чаще всего предварительно изолируют фракцию клеточных ядер или выделяют дезоксирибонуклеопротеиды, отмывая их солевыми растворами в физиологических концентрациях в присутствии ЭДТА или других соединений, связывающих двухвалентные катионы, необходимые для проявления ферментативной активности дезоксирибонуклеаз. После удаления основной массы белков препараты дополнительно депротеинизируют хлороформом с октанолом или фенолом. Нередко их обрабатывают также рибонуклеазами и протеолитическими ферментами, обычно проназой.

Для получения ДНК из бактерий обычно пользуются методом Мармура. который заключается в отмывании бактериальной массы 0,15 М Nad, содержащим 0,015 М цитрат натрия, лизисе клеток при 60° и рН 8,0 в 0,15 М NaCI, содержащем ЭДТА и 2% додецилсульфат натрия, депротепнизации их хлороформом, содержащим изоамиловый спирт, переосаждении спиртом, повторной многократной депротеинизации, обработке рибонуклеазой и осаждении изопропиловым спиртом. Этот метод в различных модификациях также успешно применяют для получения ДНК из животных и растительных тканей и изолированных клеточных структур, например, митохондрий.

3. Химический состав и физико-химические свойства ДНК

ДНК представляют собой многоосновные сильные кислоты, щелочные соли которых образуют в воде очень вязкие прозрачные коллоидные растворы, застывающие при концентрации выше 0,25%. Растворы ДНК характеризуются аномальной (структурной) вязкостью, объясняющейся удлиненной формой молекул, и в потоке обладают двойным, лучепреломлением.

Химически ДНК представляют собой высокомолекулярные полимеры монодезоксирибонуклеотидов (мононуклеотидов), являющиеся мономерами, из которых построены молекулы

ДНК. Каждый мононуклеотид ДНК состоит из остатков фосфорной кислоты, 2-П-дезоксирибозы и пуринового или пиримидинового азотистого основания. Углеводно-фосфатный остаток одинаков во всех мономерах ДНК, азотистое основание же может быть представлено аденином (А), гуанином (Г), цитозином (Ц) или тимином (Т). В ДНК разных организмов имеется некоторое количество так называемых, минорных оснований, например 5-метил-цитозина, частично заменяющего цитозин. У высших животных и человека содержание этого основания достигает 1,5%, у высших растений 5--7% , у бактерий -- не более 0,6% . В ДНК бактерий встречается также 6-метиладенин и иногда другие метилированные азотистые основания. В ДНК Т-четных бактериофагов (Т2, Т4 и Т6) цитозин полностью замещен 5-оксиметилцитозином, в ДНК вирусов SP01 и SP8 тимин замещен 5-оксиметилурацилом, а у фага PBS1 -- урацилом.

В мононуклоотидах 2-П-дезокси-рибоза присоединена гликозидной связью через первый углеродный атом к атому азота в 9-м положении пуринового основания (аденина или гуанина) или в 3-м положении пиримидинового основания (цитозина или тимина). Остаток фосфорной кислоты присоединен эфирной связью к 5'-му или З'-му атому углерода дезоксирибозы. Таким образом, мононуклеотидные остатки соединены между собой через фосфорную кислоту, которая соединена с 5'-С-атомом дезоксирибозы одного нуклеотида и с 3'-С-атомом дезоксирибозы соседнего нуклеотида и т. д. (схема 1).

Схема 1. Соединение нуклеотидов в молекуле ДНК.

ДНК из различных источников отличаются друг от друга по соотношению входящих в их состав азотистых оснований, то есть по нуклеотидному составу, однако нуклеотидный состав всех ДНК подчиняется определенным закономерностям -- правилам Чаргаффа, согласно которым:

1) число молекул аденина равно числу молекул тимина; 2) число молекул гуанина равно числу молекул цитозина; 3) число молекул пуриновых оснований равно числу молекул пиримидиновых оснований;

4) число 6-аминогрупп в молекуле ДНК равно числу 6-кетогрупп, то есть сумма аденин + цитознн равна сумме гуанин + тимин. Записав правила Чаргаффа буквенными обозначениями, получим следующие выражения: 1) А - Т; 2) Г - Ц; 3) А + Г = Т + Ц; 4) А + Ц = Г + Т. Эти правила сохраняют силу и в том случае, если приведенные азотистые основания замещены их метилированными или другими производными (минорными основаниями). Таким образом, нуклеотидный состав ДНК характеризуется молярным отношением (фактором специфичности) или процентом ГЦ-пар, т.е. . Величина этого показателя одинакова для ДНК различных органов и тканей одного организма и практически не отличается у разных видов животных и растений в пределах одного класса. Она достаточно близка у высших растений и животных (позвоночных) -- от 0,55 до 0,93. У бактерий, по данным А. С. Спирина и А. Н. Белозерского, величина фактора специфичности колеблется от 0,35 до 2,73 или от 26,8 до 74,2% ГЦ-пар.

Рентгеноструктурный анализ ДНК показал, что пуриновые и пиримидиновые основания нуклеотидных остатков ДНК лежат в одной плоскости, перпендикулярной продольной оси молекулы, тогда как циклы дезоксирибозы находятся в плоскости, почти перпендикулярной той, в которой лежат циклы оснований. Расстояния между азотистыми основаниями отдельных нуклеотидов составляют 3,4 А. В соответствии с этими данными и с правилами Чаргаффа Дж. Уотсон и Ф. Крик построили модель молекулы ДНК (схема 2). Дальнейшие исследования подтвердили их правоту. Установление строения молекулы ДНК явилось крупнейшим открытием в области молекулярной биологии. Согласно модели Уотсона - Крика, молекула ДНК представляет собой двойную спираль, построенную из двух полинуклеотидных цепочек, направленных антипараллельно, то есть если в одной цепочке остаток фосфорной кислоты связывает отдельные нуклеотиды от 5'- к 3'-С-атомам снизу вверх, то в другой цепочке эти связи направлены сверху вниз. Каждая цепочка состоит из углеводно-фосфорного скелета, присоединенные к углеводному компоненту азотистые основания ориентированы внутрь и соединены между собой попарно водородными связями, а именно А- с Т и Г - с Ц. Аденин с тимином соединены двумя Н-связями, тогда как гуанин с цитозином соединены еще третьей водородной связью (схема 3). Двойная спираль закручена вправо, причем полному витку спирали соответствуют 10 пар нуклеотидных остатков, занимающих расстояние в 34 А,-- В-форма. В-форма устойчива в среде с высокой влажностью (97% насыщенного пара). Вся молекула ДНК представляет собой жесткий, неветвящийся линейный полимер. В условиях низкой влажности (с 76% насыщения) двойная спираль ДНК принимает А-форму, в которой полный виток спирали занимает расстояние в 28 А, причем меняется также положение плоскости, в которой расположены азотистые основания, и число оснований на полный виток (один виток содержит 11 нуклеотидов).

В хроматине ДНК образует комплексы с гистонами. Такие нуклеогистоны находятся в сверхспирализованном состоянии, причем суперспираль имеет радиус 50 А и расстояние между витками 120 А. В хромосомах и частично в хроматине такие суперспирали дезоксирибонуклеопротеида закручены в спирали высших порядков с диам. 250 и 500 А.

Молекулярный вес (масса) ДНК неодинаков и зависит от источников получения образца ДНК. Помимо этого, даже при самых тщательных и щадящих процедурах выделения ДНК подвергается некоторой деградации и ее молекулярный вес может быть ниже, чем в клетках. Препараты, получаемые современными методами из тканей животных н растений, имеют мол. вес 6-106--10-106, однако истинный мол. вес ДНК животных и растений, как показывают методы определения мол. веса по вязкости и по длине молекул (lA двуспиральной ДНК в В-форме соответствует 197 единицам молекулярного веса), значительно выше и может достигать десятков миллиардов. Таким образом. молекулы ДНК хромосом являются самыми крупными молекулами из всех известных биополимеров.

Схема 2. Двойная спираль молекулы ДНК (модель Уотсона--Крика): А -- аденин; Т -- тимин, Г -- гуанин; Ц -- цитозин; Д -- дсзоксирибоза; Ф -- фосфат; 34 А -- величина витка, спирали; 10 А -- радиус спирали; 3, 4 А -- расстояние между нуклеотидами; стрелки указывают направление витка спирали.

Схема 3. Соединение пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК (точками обозначены водородные связи).

У некоторых вирусов, например у бактериофагов Ф Х174, fd и М13, ДНК представлена одной полинуклеотидной цепью, замкнутой в кольцо и имеющей сравнительно небольшой мол. вес -- 1,7-106. У большинства вирусов ДНК представляет собой двойную спираль, линейную пли замкнутую в кольцо; нередко такие формы переходят друг в друга, причем эти молекулы имеют так называемые «липкие концы», содержащие однонитчатые комплементарные друг другу нуклеотидные последовательности, при помощи которых молекула замыкается в кольцо. Для ДНК характерно сильное поглощение в ультрафиолетовой части спектра при длине волны около 260 нм. Удельное поглощение высокополимерной ДНК в растворе, содержащем выше 10-3 М NaCI, при рН 7,0 составляет около 6000 на 1 г-атом фосфора. ДНК сравнительно легко деполимеризуются под действием некоторых химических соединений, ультразвука, ионизирующей и ультрафиолетовой радиации; нагревание ДНК с разведенными минеральными кислотам приводит к отщеплению пуринов (аденина и гуанина) и образованию «апуриновой кислоты», содержащей только пиримидиновые основания. Нагревание растворов ДНК, а также их подщелачивание и т.п. вызывают денатурацию ДНК, заключающуюся в плавлении двойной спирали (разрыве водородных и гидрофобных связей) и расхождении полинуклеотидных цепочек. Денатурация сопровождается понижением вязкости раствора и повышением поглощения в ультрафиолете, по чему можно контролировать этот процесс. Температура плавления (температура, при которой денатурирована половина ДНК) тем выше, чем больший процент ГЦ-пар содержится в ДНК; этот показатель может служить для определения нуклеотидного состава ДНК. Установлено, что (не линейно связана с составом ДНК: 1° соответствует 2,5 молярным % ГЦ-пар. Гомогенные препараты ДНК (например, вирусной ДНК) характеризуются плавлением с резким переходом, тогда как гетерогенные препараты дают сравнительно широкую зону плавления, что может служить мерой гетерогенности ДНК. При быстром охлаждении после денатурации ДНК не восстанавливает своих нативных свойств, однако при медленном охлаждении полинуклеотидные цепочки реассоциируются по принципу комплементарности и таким образом происходит ренатурация молекул ДНК. При медленном охлаждении денатурированной ДНК в присутствии РНК полинуклеотидные нити ДНК и РНК могут ассоциироваться но принципу комплементарности пар гуанина с цитозином и аденина с урацилом (вместо тимина), образуя двунитчатые гибриды ДНК -- РНК. Метод гибридизации широко применяется для исследования комплементарности и структуры двух типов нуклеиновых кислот, а также ДНК из разных источников. Изучение ренатурации ДНК показало, что ДНК высших организмов содержат повторяющиеся последовательности, которые можно разделить на очень часто повторяющиеся последовательности и относительно часто повторяющиеся. Кроме того, имеются и уникальные последовательности. К повторяющимся последовательностям, по-видимому, относятся регуляторные гены, а также гены, кодирующие рибосомные РНК, транспортные РНК и гистоны. Структурные гены, как правило, относятся к уникальным последовательностям, что доказано для таких активных генов, как гены глобина в эритробластах и гены фиброина в шелкоотделительной железе шелкопряда. У низших организмов (прокариотов) -- вирусов и бактерий, а также в митохондриях ДНК не содержит или почти не содержит повторяющихся последовательностей. В ДНК ряда организмов обнаружены участки, в каждой из нуклеотидных цепей которых имеются последовательности оснований, повторяющиеся далее, но в обратном порядке. Поскольку такие последовательности читаются одинаково с обоих концов, как, например, слово «потоп», они получили название палиндромов. Палиндромы в ДНК и в синтезированных на их матрице РНК могут образовывать крестообразные структуры, физиологическую роль которых, возможно, связана с инициацией (началом) синтеза РНК или белков.

Методом молекулярной гибридизации показано, что в ядерной ДНК плодовой мушки Drosophila melanogaster около 75% всей ДНК представлено уникальными последовательностями, около 15% -- очень часто (до 1 000 000 раз) повторяющимися и около 10% -- относительно часто (1000--100 000 раз) повторяющимися нуклеотидными последовательностями. Очень часто повторяющиеся последовательности расположены главным образом в плотном хроматине, цитологически описываемом как гетерохроматин; они встречаются чаще всего в так называемой сателлитной ДНК, обычно отличающейся от основной массы ДНК по нуклеотидному составу и отделяемой от нее при равновесном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Такие сателлиты содержатся почти у всех эукариотов и составляют от 1% до половины всей массы генома. Даже у близкородственных видов количество сателлитной ДНК может существенно отличаться. Относительно часто повторяющиеся последовательности распределены между гетеро- и эухроматином. Значительная часть дезоксирибонуклеопротеида хроматина состоит из чередующихся участков повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК. Заметные количества ДНК, содержащей относительно часто повторяющиеся последовательности, находятся также в хроматине, ассоциированном с ядрышками и кодирующем рибосомные РНК.

Первичная структура ДНК трудно поддается изучению уже потому, что молекулы ДНК имеют огромные размеры. Некоторую информацию о последовательности нуклеотидов дает изучение пиримидиновых блоков. При обработке ДНК концентрированной муравьиной кислотой, содержащей дифениламин, происходит отщепление пуриновых оснований и дальнейший гидролиз ДНК. В молекуле сохраняются пиримидиновые последовательности, остающиеся в блоках, представляющих собой олигодезоксинуклеотиды, лишенные пуриновых мономеров. Такие блоки разделяют с помощью хроматографии на изоплиты -- олигомеры, содержащие одинаковое число нуклеотидных остатков, затем их в свою очередь разделяют и анализируют. Подобным образом изучают пуриновые блоки, получаемые обработкой ДНК гидразином. Однако наибольший прогресс в изучении структуры ДНК достигнут в результате применения дезоксирибонуклеаз, расщепляющих определенные последовательности нуклеотидов, и в особенности рестриктаз, обладающих узкой специфичностью в отношении коротких нуклеотидных последовательностей в 6--7 нуклеотидов. Более детальную информацию в отношении нуклеотидной последовательности в молекулах ДНК, представляющих собой структурные гены, получают путем анализа нуклеотидной последовательности в соответствующих им РНК и белках. Удалось установить последовательность нуклеотидов в небольших молекулах сателлитной ДНК у высших организмов, выяснена также нуклеотидная последовательность в довольно значительных участках ДНК у некоторых вирусов, бактерий и др.

Метилирование азотистых оснований в составе ДНК происходит уже после синтеза молекулы и относится к так называемом постсинтетическим изменениям или модификациям.

У Е. coli метилируется аденин, находящийся как раз в той короткой последовательности нуклеотидов, которая «узнается» рестрикислотазой R1. По-видимому, рестриктазы избирательно разрушают чужеродные ДНК, попадающие в бактерию, в собственной же ДНК «узнаваемые» ими последовательности защищены метильными группами.

4. Методы количественного и качественного определения и исследования

Большинством цветных химических реакций ДНК обязаны своему углеводному компоненту -- дезоксирибозе. Под действием кислот ДНК легко отщепляет пуриновые основания, причем освобождается альдегидная группа дезоксирибозы. В результате дальнейшего действия кислоты дезоксирибоза претерпевает превращения с образованием w-оксилевулинового альдегида: ответственного, по-видимому, за образование окраски с реактивами на ДНК.

Чаще других реакций для обнаружения и количественного определения ДНК применяют нагревание с дифениламином в концентрированной уксусной кислоте в присутствии концентрированной серной кислоты. Эту реакцию обычно применяют в модификации Бертона (К. Burton) при 30° в присутствии уксусного альдегида. Реже применяются менее чувствительные цветные реакции с цистеином, с триптофаном или индолом, а также с карбазолом. Иногда применяют также цветную реакцию с ганитрофенилгидразином. Весьма чувствительным является флюориметрический метод, позволяющий определять до 3.10-9 г ДНК.

Для количественного определения ДНК необходимо ее предварительное отделение от РНК и (по возможности) от других веществ, мешающих применяемой реакции. Для этих целей обычно пользуются методом Шмидта и Таннгаузера (G. Schmidt, S. J. Thannhauser) в различных модификациях. Принцип метода заключается в осаждении нуклеиновых кислот вместе с белками трихлоруксусной или хлорной кислотой, отмывании кислоторастворимых фосфорных соединений, экстрагировании липидов и извлечении нуклеиновых кислот при помощи гидролиза 5% трихлоруксусной кислотой при 90° в течение 15--20 мин. Белки при этом остаются в осадке; из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты и подвергнутого гидролизу 0,3-- 1,0 н. щелочью, вызывающей распад РНК до нуклеотидов, ДНК осаждают подкислением трихлоруксусной или хлорной кислотой. Осадок отмывают и ДНК экстрагируют горячей хлорной кислотой. Содержание ДНК определяют по фосфору, спектрофотометрически или при помощи специфических цветных реакций, но спекислотрофотометрический метод является наиболее простым и быстрым для определения ДНК после отделения ее от других веществ, характеризующихся максимумом поглощения при 260 нм.

При определении нуклеотидного состава ДНК последнюю подвергают гидролизу хлорной кислотой и отщепившиеся пуриновые и пиримидиновые основания разделяют хроматографией на бумаге или на ионообменниках. Хорошие результаты дает также хроматография в тонком слое на производных целлюлозы и др. Поскольку в обычных двуспиральных ДНК нуклеотидный состав подчиняется определенным правилам (правила Чаргаффа), он может быть выражен в виде процентного содержания ГЦ-пар. Молярный процент ГЦ-пар вычисляют, используя температуру плавления ДНК (температура, при которой денатурирована половина ДНК), по формуле: процент ГЦ-пар = 2,44 ((°пл -- 69,3°). Коэффициенты, приведенные в формуле, рассчитаны эмпирически и варьируют в зависимости от ионной силы, ионного состава и величины рН раствора. Хорошие результаты при определении нуклеотидного состава ДНК дает метод улътрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Плавучая плотность ДНК при этом линейна связана с молярным содержанием ГЦ-пар (изменение содержания ГЦ-пар на 1% изменяет плавучую плотность на 0,001 единицы) и определяется по уравнению: молярное содержание ГЦ-пар = 10,2 .(р -- 1,660), где р -- плавучая плотность исследуемого препарата ДНК. Для чистых препаратов ДНК нуклеотидный состав можно определить также по спектру поглощения в 0,1 М уксусной кислоте по формуле, предложенной Фредериком (Е. Fredericq).

Страницы: 1, 2