Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия

3. Вращение мембранных белков

Коэффициент вращательной диффузии мембранного белка, находящегося в плоскости бислоя, D., можно найти, представив белко

вую молекулу в виде цилиндра, который вращается вокрут одной оси. Пусть мембрана имеет вязкость г) и толщину h, а радиус цилиндра равен а. Тогда

Часто наряду с фу применяется время вращательной релаксации ф, = 1/. Для белковой молекулы радиусом 25 А, находящейся в мембране толщиной 40 А и вязкостью 5 пуаз, величина ф, по оценкам составляет около 35 мкс. С количественной точки зрения это уравнение, описывающее вращение белка в бислое, не вполне строго, но зависимость времени вращательной релаксации от эффективного радиуса вращающейся белковой молекулы сомнений не вызывает. Это оказалось весьма полезным для исследования процессов агрегации белков внутри мембраны. Методы, применяемые для изучения вращения белков в бислое, должны быть способны регистрировать времена вращения от 10"5 до 10 ~3 с. Обычный метод измерения деполяризации флуоресценции в этом случае непригоден, поскольку время жизни молекул в возбужденном состоянии составляет около 10"8 с, и в таком временном масштабе молекулы белков представляются неподвижными. Успешно использовались три метода.

1. К исследуемому белку присоединяют зонд, время жизни которого в возбужденном триплетном состоянии достаточно велико. Если метка жестко связана с белком, то для регистрации вращения белка можно использовать измерение анизотропии фосфоресценции. Для таких измерений оказались пригодными производные эозина, поскольку время жизни эозина в триплетном состоянии составляет примерно 2 мс. В основе этого подхода лежат те же принципы, что и в основе метода деполяризации флуоресценции, но используется другая молекулярная модель движения, вызывающего деполяризацию. Эксперимент состоит в определении характерного времени затухания анизотропии фосфоресценции. Если система гетерогенна, могут возникнуть определенные трудности, связанные с количественным анализом экспоненциальной кривой затухания анизотропии. Проблемы возникают и в тех случаях, если метка может локально вращаться на поверхности мембранного белка или если у белковой молекулы имеются гибкие сегменты.

Те же метки могут использоваться и для анализа вращения белков с использованием временной зависимости дихроизма поглощения. В этом случае изменения в ориентации дипольного момента перехода регистрируются по поглощению света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси поляризации начального импульса, используемого для возбуждения молекул.

Известны случаи, когда сами молекулы белка содержат группы, переходящие при флеш-фотолизе в долгоживущее возбужденное состояние, параметры которого можно оценить с помощью дихроизма поглощения. В качестве примера можно привести родопсин и бактериородопсин, где используются возбужденное состояние связанного ретиналя и возбужденные состояния, наблюдающиеся при фотолизе комплексов цитохром--СО с использованием цитохром с-оксидазы и цитохрома Р450. Измерения можно проводить in situ или с очищенным белком, встроенным в фосфолипидные везикулы.

С помощью обычной ЭПР-спектроскопии не удается регистрировать вращения, характерная частота которых равна частоте вращения мембранных белков. Однако разработан специальный метод -- ЭПР с переносом насыщения, диапазон чувствительности которого очень широк -- от 10"7 до 10 ~J с. Этот метод применялся при изучении вращения нескольких мембранных белков с ковалентно пришитыми к ним спиновыми метками. Недостаток метода состоит в том, что в случае анизотропного молекулярного движения спектры с трудом поддаются интерпретации.

3.1 Примеры вращения белков

Внутримембранные белки характеризуются широким спектром времен вращательной релаксации. На одном конце временной шкалы находится родопсин, который, по-видимому, свободно вращается в мембране наружного сегмента палочки сетчатки, а на другом -- бактериородописин, который образует в пурпурной мембране упорядоченную кристаллическую решетку и неподвижен. Для нескольких очищенных белков, встроенных в фосфолипидные везикулы, зависит от концентрации. Это позволяет предположить, что при уменьшении соотношения липид/белок происходит самоагрегация этих белков. Такая картина характерна для бактериородопсина, цитохром с-оксидазы, белка полосы 3, Са2 + -АТРазы и цитохрома Р450. Возможно, именно с самоагрегацией связана гетерогенность, наблюдаемая, в частности, для белка полосы 3 в тенях эритроцитов и Са2 + -АТРазы из саркоплазматического ретикулума. Вообще говоря, мембранные белки, по-видимому, вращаются в плоскости мембраны и скорость вращения согласуется с величиной, ожидаемой исходя из простой гидродинамической модели.

Дополнение. Вращение белка полосы 3 и цитохрома Р450: выявление межмолекулярных взаимодействий

Из двух указанных белков -- белка полосы 3 и цитохрома Р450 -- наибольший интерес представляет первый, поскольку по имеющимся биохимическим данным можно предположить, что этот анионный переносчик связан со спектрино-актиновой сетью цитоскелета. Обнаружение того факта, что значительная часть белковых молекул способна к быстрому вращению, послужило основанием для создания моделей, согласно которым белок полосы 3 иммобилизован не полностью или образует со спектрином временную связь. Однако ситуация осложнялась тем, что при лизисе клеток, необходимом для получения теней эритроцитов, комплекс с цитоскелетом может разрушаться. В интактной клетке белок полосы 3 совершает только медленные вращательные движения с характерным временем 0,1 -- 1 мс. Это больше согласуется с отсутствием поступательного движения белка полосы 3, хотя физическая причина такого ограничения подвижности не установлена.

Цитохром Р450 акцептирует электроны от цитохром Р450-редук-тазы в электронтранспортной цепи микросом. Многих ученых интересовал вопрос: образуют ли эти молекулы долгоживущий комплекс в мембране или их взаимодействие сводится к простым столкновениям в результате диффузии? При низком соотношении липид/белок цитохром Р450 агрегирует и вращение его замедляется. Однако в присутствии стехиометрических количеств редуктазы цитохром Р450 в сходных условиях остается мобильным. Это свидетельствует о взаимодействии двух указанных белков и образовании комплекса между ними со стехиометрией 1:1, которое препятствует агрегации Р450.

4. Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах

Способность мембранных компонентов к латеральной диффузии -- это одно из очевидных условий, принятых в жидкостно-мозаичной модели. Для измерения коэффициента латеральной диффузии применялось несколько методов. Рассмотрим три из них.

Осуществляют слияние клеток, несущих на своей поверхности различные маркеры, с образованием гетерокарионов. После слияния оценивают скорость перераспределения поверхностных маркеров с помощью флуоресцентной микроскопии и с использованием меченных различными флуоресцентными метками антител против специфических поверхностных антигенов.

Осуществляют перераспределение мембранных белков с помощью электрофореза in situ. При внесении клеток в электрическое поле белки концентрируются в одной части мембраны, и коэффициент латеральной диффузии определяют по данным о скорости их перераспределения после отключения электрического поля. За перераспределением белков можно наблюдать с помощью электронной микроскопии или флуоресцентных методов.

Чаще всего используется метод, основанный на восстановлении способности белков к флуоресценции после фотообесцвечивания. Суть метода представлена на рис. 5.6. С помощью мощного лазерного луча обесцвечивают пятно диаметром - 1 мкм на равномерно меченной с помощью флуоресцентной метки мембране. Далее исследуют кинетику разгорания флуоресценции этого участка и по скорости восстановления флуоресценции прямо оценивают скорость латеральной диффузии флуоресцентных зондов на обесцвеченный участок из областей мембраны, прилегающих к нему. С помощью этого метода можно исследовать амфифильные флуоресцентные зонды, меченые фосфолипиды и белки, несущие флуоресцентные метки. Структурные формулы некоторых наиболее часто используемых зондов приведены в табл. 5.1. Можно ожидать, что применение видеотехники для изучения перераспределения флуоресцентных молекул в мембране расширит рамки применения этого метода. Использование двух первых методов сопровождается значительными нарушениями клеток или мембран. Метод FRAP является более щадящим. Опасения, связанные с возможностью повреждений клеток лазерным лучом, были сняты. Метод можно также применять для исследования модельных мембранных бислоев и монослоев, а также интактных клеток или фрагментов биомембран. Фокусируя лазерный луч диаметром ~ 1 мкм в разных точках, можно наблюдать за датеральной диффузией мембранных компонентов в различных участках мембраны.

Коэффициенты поступательной диффузии, которые можно определить с помощью этого метода, варьируют от Ю-7 до 10 ~12 см2/с. Коэффициент диффузии 10 "12 см2/с в рамках этого подхода соответствует отсутствию движения. Значение D = 10 "8 см2/с, характерное для липидов в биомембранах, отвечает диффузии на расстояние около 2 мкм за 1 с.

4.1 Модели, описывающие латеральную диффузию

Для описания поступательной диффузии мембранных белков часто применяется гидродинамическая модель Саффмана и Дельбрюка. В этой модели рассматривается диффузия белка в тонком вязком слое; при этом считается, что растворитель является сплошной средой, т. е. молекулы растворителя малы по сравнению с диффундирующими молекулами. В рамках этой модели выполняется следующее соотношение:

где т)м и 1), -- вязкости мембранной и водной фаз соответственно, а -- радиус белковой молекулы, имеющей форму цилиндра, h -- толщина мембраны. Из модели следует, что скорость поступательной диффузии слабо зависит от размера молекулы, что подтверждается полученными к настоящему времени экспериментальными данными.

Эта гидродинамическая модель не позволяет описывать диффузию липидных зондов, поскольку к ним неприменимо допущение о том, что белок диффундирует в сплошной среде. Для объяснения поведения липидов применялись различные модели, основанные на концепции свободного объема. В рамках этих моделей диффузия рассматривается как процесс движения молекул в полостях, образующихся вследствие спонтанных флуктуации, при этом определяющей характеристикой мембран является отношение площади, приходящейся на одну молекулу липида, к минимальной Удельной площади, соответствующей максимально плотной упаковке липидов, т. е. плотность упаковки липидов. Как мы уже отмечали, скорость вращения флуоресцентных зондов зависит от плотности упаковки липидов в мембране. Применимость этой модели к описанию вращательной или поступательной диффузии липидов строго не доказана, поскольку изначально она была построена для неассоциированных жидкостей, к которым можно отнести далеко не все мембранные липидные структуры. Тем не менее обратная зависимость между скоростью поступательной диффузии липидов и плотностью упаковки липидов в мембранном бислое обычно существует.

Наконец, несколько подходов использовалось для теоретического объяснения влияния мембранных белков на латеральную диффузию белков и липидов в мембране. Дело в том, что белки оказываются на пути диффундирующих молекул и вынуждают их перемещаться только в пространстве, не занятом белками. Обычно из-за этого коэффициенты поступательной диффузии в биомембранах оказываются примерно в 10 раз меньше, чем в чисто липидных бислоях.

4.2 Примеры латеральной диффузии компонентов мембран

Коэффициенты поступательной диффузии некоторых мембранных липидов и белков приведены в табл. 5.2. Коэффициенты диффузии флуоресцентных меток и аналогов липидов в фосфолипидных мультибислоях или в крупных однослойных везикулах равен 10"8 см2/с. При изучении поведения этих же зондов в разнообразных природных мембранах коэффициент диффузии обычно оказывается примерно в 10 раз меньше. Этот феномен, как правило, объясняют присутствием в биомембранах белков, препятствующих латеральной диффузии. Скорость латеральной диффузии фосфолипидов с разными полярными головками различается слабо, однако в реконструированных везикулах гангли-озиды диффундируют медленнее. При переходе мембранного бислоя в состояние геля скорость латеральной диффузии уменьшается более чем на два порядка {D < 10" 10 см2/с). В жидком бислое модельных мембран и в биомембранах липиды обычно диффундируют свободно, хотя имеются редкие исключения.

Совсем иначе обстоит дело с латеральной диффузией мембранных белков. Исследование поведения нескольких белков в реконструированных везикулах, пока не позволяющее сделать окончательные выводы, тем не менее указывает на то, что коэффициенты поступательной диффузии белков разных размеров очень близки и что белки диффундируют лишь немного медленее, чем липиды. Исследованные белки сильно различались по числу трансмембранных сегментов и по степени ассоциированности, и тем не менее диффундировали с одинаковой скоростью. Модель Саффмана--Дельбрюка предсказывает очень слабую зависимость скорости диффузии от размеров молекул. В реконструированных везикулах с высоким содержанием белка могут происходить агрегация последнего и латеральное разделение фаз, приводящие к иммобилизации части белка.

В биомембранах коэффициенты латеральной диффузии белков обычно в 100--1000 раз меньше, чем в модельных системах с низкой концентрацией белка. Например, родопсин, по-видимому, свободно диффундирует в биомембране-- D = 4-10"9 см2/с. Поскольку мембраны, содержащие родопсин, характеризуются высоким отношением белок/липид, ясно, что обычно наблюдаемая медленная диффузия других мембранных белков не может быть обусловлена исключительно присутствием белков в бислое. Есть и еще один интересный факт: восстановление флуоресценции в экспериментах FRAP происходит не полностью и нередко составляет менее 75%. Это означает, что часть изучаемой популяции белков ^ неподвижна.

Вопрос о том, что ограничивает латеральную диффузию мембранных белков, имеет ключевое значение. Маловероятно, что это обусловлено агрегацией мембранных белков, поскольку для объяснения большинства данных потребовалось бы предположить, что образуются слишком крупные агрегаты. Одно из возможных объяснений состоит в том, что мембранные белки,малоподвижны, поскольку связаны с внеклеточным матриксом или с ци-тоскелетом. Обнаружилось, что, оказывая воздействие на внеклеточный матрикс, можно влиять на латеральную диффузию мембранных белков, однако имеются и другие данные, согласно которым эта связь не столь уж важна.

О взаимодействиях между мембранными белками и элементами цитоскелета, ответственных за некоторые из наблюдаемых ограничений латеральной диффузии белков, свидетельствуют разные данные. Белок полосы 3 в мембранах эритроцитов в норме в основном неподвижен, но в клетках с недостатком спектрина его латеральная подвижность возрастает по меньшей мере в 40 раз. При нарушениях цитоскелета в тенях эритроцитов латеральная диффузия белка полосы 3 также возрастает. Проводились опыты по изучению диффузии ацетилхолиновых рецепторов во вздутиях в мембранах, где связь с актином и элементами цитоскелета нарушена. Подвижность белка в таких системах была гораздо выше, чем в клетках с интактным цитоскелетом. Тем не менее, гипотезу о том, что низкая подвижность мембранных белков обусловлена их связью с цитоскелетом, нельзя считать бесспорной.

Известен по крайней мере один случай, когда взаимодействия с цитоскелетом не сказываются на латеральной диффузии. G-белок вируса везикулярного стоматита находится в плазматической мембране инфицированных животных клеток и имеет единственный трансмембранный сегмент. Были получены мутантные формы этого белка, у которых цитоплазматический домен отсутствовал. Ни для одного из мутантов не наблюдалась быстрая латеральная диффузия, которая характерна для мембранных белков, встроенных в искусственные бислои. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямые взаимодействия между данным белком и цитоплазматическими белками не приводят к уменьшению латеральной подвижности.

Наконец, следует отметить, что с помощью метода FRAP, используемого в большинстве этих экспериментов, была зарегистрирована диффузия на расстояние от нескольких сотен А до 1 мкм. Белок может свободно диффундировать внутри небольшого домена, но встречать препятствия на своем пути в присутствии других интегральных или периферических белков, и при использовании метода FRAP будет считаться неподвижным. Кроме того, если бы взаимодействие между мембранными белками и белками цитоскелета было относительно слабым и частота их ассоциации и диссоциации была достаточно высока, белок мог бы перепрыгивать с одного сайта связывания на другой. В результате суммарная скорость латеральной диффузии уменьшилась бы, поскольку белок большую часть времени находился бы в связанном с цитоскелетом состоянии, но скорость движения белка между сайтами связывания была бы высока. Образование кластеров мембранных белков за счет притяжения между ними также приводит к уменьшению латеральной диффузии.

5. Липидно-белковые взаимодействия

Большинство методов, применяемых для изучения упорядоченности и динамических свойств мембран, используется и для исследования липидно-белковых взаимодействий. Работы по изучению этих взаимодействий были в основном направлены на выяснение влияния мембранных белков на физическое состояние липидов. Рассмотрим типичную мембрану с весовым соотношением липид/белок = 1:1. При средней мол. массе белка 50 кДа молярное соотношение липид/белок составляет -60:1 при условии, что присутствуют только фосфолипиды. Для сравнения укажем, что соответствующие соотношения для мембраны наружного сегмента палочки сетчатки и саркоплазматического ретикулума составляют по оценкам 75:1 и 110:1. Если белок представляет собой цилиндр, выступающий за пределы бислоя с обеих сторон примерно на 10 А, то его радиус должен составлять около 18 А. Молекула фосфолипида в жидкой мембране занимает площадь ~60А2, что соответствует радиусу головки ~4,4 А, и для того, чтобы полностью окружить белок, иа каждой стороне бислоя должно находиться около 16 таких молекул липидов. Следовательно, согласно этой модели, в любой момент времени около 50% липидов должно соседствовать с белковыми молекулами. Однако белком занято 35% площади поверхности мембраны, и даже учитывая сугубо приближенный характер этой модели, можно понять, что физические методы регистрации состояния липидов должны учитывать влияние белков на свойства биомембран.

Чтобы выяснить структуру и функции мембран, необходимо прежде всего ответить на следующие вопросы: 1) насколько прочно связаны внутримембранные белки с липидами и какова природа ли-пидного слоя, прилегающего к белку? 2) как далеко простирается влияние мембранных белков на укладку и динамические свойства мембранных липидов? 3) как влияют липиды на структуру и функции внутримембранных белков? 4) как периферические мембранные белки, связанные с поверхностью бислоя, взаимодействуют с липидами и влияют на их поведение?

5.1 Связывание липидов с внутримембранными белками в бислое

Этой теме были посвящены многочисленные исследования, в которых использовались разнообразные подходы. По существу во всех этих работах ставилась задача выяснить, есть ли у белков участки, специфически взаимодействующие с определенными липидами, и можно ли считать белково-липидные комплексы долгоживущими, т. е. обладают ли они временем жизни, сравнимым с временем оборота типичного фермента. Такие исследования проводились с помощью Н-ЯМР, ЭПР и флуоресцентных методов. Чтобы разобраться в полученных результатах, полезно рассмотреть термодинамику простой реакции обмена, где липид одного типа вытесняется с места связывания на белке другим липидом:

Константа равновесия этой реакции равна

Она является относительной константой связывания липидов Li и L2 с данным участком белковой молекулы, причем

Если липиды двух типов присутствуют в мембране в одинаковой концентрации и сродство их к белку одинаково, то К = 1. Рассмотрим гипотетический случай, когда L2 является минорным липидным компонентом и составляет только 5°/о от общего количества липидов. Тогда

Предположим, что L2 предпочтительно связывается с неким участком белковой молекулы, так что в равновесии 90% участков занято L.2. Тогда

Следовательно, К = 171, что соответствует величине ДС° = = -3,1 ккал/моль. Столь небольшого различия в свободной энергии связывания оказывается достаточно для существенного смещения распределения липидов, связанных с белком, от равновесного состояния. Это обусловлено тем, что соотношение эффективных концентраций конкурирующих липидов в мембране относительно мало: не превышает 100, а в большинстве случаев гораздо меньше. Другими словами, даже минорные липиды присутствуют в мембране в концентрации, составляющей не менее 1% от концентрации основных липидов, с которыми они конкурируют за места связывания на белках.

Для оценки относительного сродства липидов к специфическим белкам используют два подхода. Они основаны на применении липидных аналогов, встроенных в фосфолипидные везикулы, которые содержат интересующий исследователя белок.

1. Спин-меченные фосфолипиды, соседствующие с мембранными белками, обладают ограниченной подвижностью. Это проявляется в уширении спектра ЭПР. У тех молекул ЭПР-зонда, которые соседствуют с белком, возможность движения с характерной частотой > 108 с" 1 существенно ограничена. Спектр ЭПР в этом случае может быть представлен в виде суммы двух компонент: компоненты с узкими спектральными линиями, соответствующей основной липидной фазе, и компоненты, отвечающей липидам с ограниченной подвижностью. Для того чтобы эта последняя была в спектре преобладающей, отношение белок/липид должно быть достаточно высоким. Осложняет картину то, что липиды могут попадать в «ловушки» из белковых агрегатов. Такие липиды тоже обладают ограниченной подвижностью, и им соответствует третья компонента в спектре ЭПР. Для выявления попавших в ловушку липидов при высоких концентрациях белка можно использовать липидные спиновые зонды, ковалентно связанные с поверхностью белка.

2. Спин-меченные и бромированные липидные производные способны тушить флуоресценцию триптофана, входящего в состав мембранных белков. Эффективность тушения зависит от расстояния между липидным производным и остатком триптофана, и присутствие таких липидов в слое, непосредственно прилегающем к белку, приведет к тушению флуоресценции белка. Относительную способность этих липидов связываться с белком в присутствии различных конкурирующих липидов можно исследовать путем измерения интенсивности флуоресценции белка.

Анализ экспериментальных данных, но на практике такие измерения трудно осуществить. Как правило, считается, что все места связывания одинаковы. В одном из вариантов исследуют связывание небольшого количества спин-меченного липида данного типа в присутствии большого количества липида другого типа. При этом снимаются спектры образцов с разным соотношением между липидами и белками. В предположении, что имеется N одинаковых мест связывания, выполняется следующее соотношение. Трудности здесь могут возникнуть из-за гетерогенности мест связывания как по сродству к липидам, так и по способности связанных липидов тушить флуоресценцию триптофана. Однако флуоресцентный метод имеет то преимущество, что при высоких значениях отношения липид/белок агрегация белка создает меньшие проблемы, чем при использовании метода ЭПР.

Страницы: 1, 2, 3