4.3 Получение персистентно инфицированных клеточных культур
1. Уникальные особенности пневмовирусов1.1 Общее введениеВ состав группы пневмовирусов входят респираторно-синцитиальный вирус человека, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей. Прототип этой группы, респираторно-синцитиальный вирус, - это плеоморфный оболочечный вирус, геном которого представлен несегментированной РНК негативной полярности. РСВ принадлежит роду Pneumovirus, который вместе с родами Paramyxovirus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae. Однозначно доказана этиологическая роль РСВ при ежегодных вспышках респираторных заболеваний у детей. Уникальность биологических, биохимических и клинических характеристик этого вируса не позволяет объединить его с представителями рода Paramyxovirus. РСВ обнаруживают у сельскохозяйственных животных; РСВ крупного рогатого скота вызывает у животных респираторное заболевание. Антитела к РСВ часто присутствуют и в сыворотке крови других домашних и лабораторных животных, контактирующих с человеком, но выделение вируса от этих животных не описано. Изоляты РСВ, выделенные от человека и крупного рогатого скота, имеют антигенное родство; среди человеческих изолятов не обнаружена связь между антигенной вариабельностью и клиникой заболеваний. Вирус пневмонии мышей, вызывающий у этих животных респираторное заболевание, не имеет антигенного родства с РСВ, однако в некоторой степени сходен с ним; во всяком случае это единственный вирус, достаточно близкий к РСВ, чтобы быть включенным в род Pneumovirus. Антитела к ВПМ с высокой частотой обнаруживаются в сыворотке крови человека; имеются неопубликованные данные, указывающие на то, что в лабораторные колонии мышей этот вирус попал от человека.Основные свойства РСВ приведены в табл.1. РСВ отличается от других парамиксовирусов большим числом идентифицированных белков, порядком генов (имеются два гена неструктурных белков, один из которых расположен между З'-концевой лидерной последовательностью и геном нуклеопротеина, а другой - между гипотетическими генами гликопротеинов F и G), отсутствием гемагглютинина и нейраминидазы, а также характерными размерами нуклеокапсида и поверхностных выступов.Таблица 1. Общие свойства пневмовирусов
Известные представители рода Нуклеиновая кислота Белки'>
Вирионные ферменты
Плавучая плотность частиц Морфология частиц
Морфология нуклеокапсида
Морфология мембранных выростов
Генетические взаимодействия
Стабильность
Круг хозяев Патогенность
Цитопатогенность
РСВ человека
РСВ крупного рогатого скота
Вирус пневмонии мышей
Однонитевая несегментированная РНК с коэффициентом седиментации 50S; мол. масса >5 - 10е
2 гликопротеина оболочки: гликопротеин G мол. масса 90 кД и связанные между собой дисульфидными связями продукты расщепления гликопротеина F
2 негликозилированных белка оболочки: белок матрикса мол. масса 26 кД и белок с неизвестной функцией мол. масса 24 кД
3 белка сердцевины: гипотетическая полимераза, нуклеокапсидный белок и фосфопротеин
Плеоморфные частицы диаметром 80^ - 500 нм и нитевидные частицы диаметром 60-ПО нм и длиной до 5 мкм.
Спиральный тип симметрии, диаметр 12 - 13 нм
Длина 10-12 нм
8 групп комплементации
Рекомбинация или множественная реактивация не обнаружены
Термолабильны, нестабильны при рН<3,0, чувствительны к замораживанию и оттаиванию
In vivo, вероятно, ограничен Ассоциированы преимущественно с респираторными заболеваниями и спорадически
с другими патологическими состояниями Образуют цитоплазматические, реже ядерные включения, часто формируют синцитии. Имеют склонность к персистенции
1.2 НоменклатураВ англоязычной литературе для обозначения респираторно-синцитиального вируса имеет смысл использовать сокращение RS-вирус, а не RSV, чтобы отличать его от вируса саркомы Рауса, типичного представителя ретровирусов. Кроме того, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота следует отличать от не родственного ему синцитий-образующего вируса, также относящегося к ретровирусам.1.3 Выделение вирусаВ связи с необычной лабильностью РСВ и низким титром в секретах и зараженных тканях при выделении этого вируса требуется особая тщательность. Попытки выделения вируса из хранившихся образцов редко бывают успешными. Имеет смысл доставлять чувствительную культуру клеток непосредственно к месту нахождения пациента или зараженного животного, а не транспортировать содержащие вирус материалы в лабораторию для заражения культуры.Чаще всего для выделения РСВ используют линии клеток Нер-2 и HeLa, однако описано использование культуры почек макак-резусов, линий BS-C-I, MRC-5, WI-38 и некоторых других. Лучшим материалом для выделения РСВ служат смывы слизистой носа или носоглотки больных детей. Смывы можно перенести в пробирку с небольшим количеством буферного раствора или бульона. Содержимое пробирок перемешивают энергичным встряхиванием. Образцы следует держать в ледяной бане и как можно скорее использовать для заражения чувствительной культуры клеток. Во всяком случае, промежуток между сбором материала и заражением культуры не должен превышать нескольких часов. Из антибиотиков наиболее часто используют пенициллин ', стрептомицин, неомицин и микостатин.Для успешного выделения РСВ важно избегать замораживания и оттаивания образцов, при их хранении поддерживать достаточно низкую температуру, как можно быстрее использовать материал для заражения чувствительной культуры и включать в состав культуральной среды ЭТС или БСА. Сыворотка взрослых домашних животных, обычно используемая для культивирования клеток, как правило, содержит достаточно высокий титр нейтрализующих РСВ антител; поэтому ее нельзя использовать при выделении этого вируса. Зараженную культуру инкубируют при 36-37 °С и наблюдают за ней не менее 3 нед, регулярно меняя среду. Для выявления ЦПД могут потребоваться дополнительные слепые пассажи. Для РСВ характерно ЦПД в виде образования синцития, но этот эффект наблюдается не всегда, и его проявление зависит от штамма вируса и типа зараженной культуры.1.4 Хранение вирусаПневмовирусы следует хранить в интервале температур от -70°С до - 198°С. При - 20°С наступает достаточно быстрая потеря инфекционное™, и в таких условиях вирус нельзя хранить более 3 мес. Лиофилизация или добавление глицерина позволяют увеличить срок хранения вируса при - 20°С. Быстрота падения инфекционности зависит от природы содержащего вирус материала; так, вирус, связанный с мембранами, более стабилен, чем свободный. 2. Основные методы2.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса2.1.1 Чувствительные культуры клетокИмеется большой набор клеточных линий, чувствительных к РСВ. В диагностических лабораториях чаще всего используют линию гетероплоидных клеток человека Нер-2, поскольку ее легко поддерживать.Тем не менее для выделения РСВ более подходят диплоидные линии клеток человека, например эмбриональных клеток легких WI-38, HeL-1, L-4, L-49, HLDC-1, - 4, - 6 и эмбриональных клеток мозга НВС-1 и НВС-4.РСВ размножается и в разнообразных культурах клеток животных, в частности в клетках почек кошек, норок и кенгуровой крысы. Степень чувствительности разных линий клеток, по-видимому, зависит от схемы пассирования используемого штамма вируса. Например, после трех пассажей через, индивидуальные бляшки на культуре клеток WI-38 полученный изолят вируса давал на этих клетках в 50 раз более высокий титр, чем вирус, пассируемый на клетках BS-C-1.РСВ может быть адаптирован и к росту в некоторых первичных культурах клеток холоднокровных животных, например черепахи Testudo graced, но он не размножается в клетках земноводных и беспозвоночных, в частности комаров. В отличие от многих других парамиксовирусов РСВ не размножается в куриных эмбрионах и культуре клеток куриного эмбриона. Кроме того, в отличие от вируса пневмонии мышей он не размножается в клетках ВНК-21.При серийном пассировании РСВ с высокой частотой образуются дефектные интерферирующие частицы. Разработан простой колориметрический метод обнаружения и количественного определения ДИЧ,Для размножения РСВ в культуре клеток можно использовать основную минимальную среду Игла, желательно с дополнительными аминокислотами. Лучший выход вируса, как правило, дают активно делящиеся клетки. Можно использовать и другие среды, например среду Лейбовича, для поддержания рН которой не требуется газообразная СОг. Температура размножения РСВ составляет 25-39 °С; максимальный выход получают при температуре около 37°С.2.1.2 Цитопатогенное действиеХарактерное для РСВ цитопатогенное действие - это образование синцития. В синцитиях ядра клеток часто образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако формирование синцития наблюдается далеко не всегда; характер ЦПД определяется многими факторами, в том числе штаммом вируса, условиями культивирования и типом клеток. Например, при заражении клеток почек африканской зеленой мартышки образуются фокусы агрегированных клеток. Под агаровым покрытием они выглядят как интенсивно окрашенные сгустки клеток, напоминающие фокусы трансформации, индуцируемые онкогенными вирусами. Однако индуцируемые РСВ фокусы окружены слабо окрашенной областью (рис.2). Ее образование обусловлено миграцией клеток к формирующемуся скоплению. Фокусы состоят из увеличившихся в размерах разбухших клеток, которые затем дают начало синцитию. Несмотря на внешнее сходство фокусов, индуцируемых онкогенными вирусами и РСВ, клетки последних не сохраняют способность к делению.2.1.3 Методы повышения инфекционное ™Обработка вируса или клеток ДЭАЭ-декстраном повышает чувствительность клеток к РСВ. При оптимальной концентрации, равной 40 мкг/мл, ДЭАЭ-декстран в 2 раза повышает выход вируса; имеются данные и о том, что число клеток, зараженных РСВ крупного рогатого скота, возрастает в этих условиях в 11 раз. Нисевич и др. сообщили о 100-кратном увеличении числа клеток, зараженных РСВ человека, в присутствии 15 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана.2.1.4 Методы стабилизации инфекционноеИнфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высоких концентраций сахарозы или ионов магния. Ферни и Герин сообщили, что в присутствии 1 М MgS04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увеличился до 12 нед. Добавление MgS04 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ для физико-химических исследований, однако при выделении вируса и определении его инфекционной активности добавление MgS04 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказывает отрицательное воздействие на культуры клеток.2.2 Методы определения инфекционностиИнфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.1. Высевают по 106 клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM. В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °С для адсорбции вируса.4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия. Удаление инокулята необязательно. В качестве покрытия можно использовать среду MEM, содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 °С среды MEM в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. При температуре 43-46 °С агар не застывает, и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39°С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации. Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара. Обычно для усиления контраста из состава агарового покрытия исключают феноловый красный, но это не имеет принципиального значения. Окрашивание раствором нейтрального красного проходит быстрее, однако такие препараты нестабильны и подвержены фотохимическому повреждению под действием света. Окрашивание с помощью твердого нейтрального красного, входящего в состав агарового покрытия, происходит медленнее, однако в тех случаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из индивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.2.3 ГемагглютинацияВ культуральной жидкости инфицированных РСВ клеток гемагглютинин не обнаруживается. Гемагглютинация с эритроцитами человека, африканской зеленой мартышки, макаки-резуса, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, гуся, овцы, свиньи, курицы и цыпленка не отмечена.С другой стороны, ВПМ агглютинирует эритроциты мыши и хомячка. Методические аспекты постановки реакции гемаглютинации описаны в работе Компанса и др.2.4 ГемадсорбцияАдсорбция эритроцитов на клетках, зараженных РСВ, не описана. Негативные результаты получены с эритроцитами африканской зеленой мартышки, шимпанзе, обезьяны гелады, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, утки, гуся, голубя, курицы и цыпленка. Однако клетки, зараженные ВПМ, связывают эритроциты мыши; технические детали описаны Ком-пансом и др. .2.5 Иммунофлуоресцентные методыИммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликлональной антисыворотки представляет собой удобный и точный метод подсчета зараженных клеток и выявления места размножения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных тканей. Используя моноклональные антитела против индивидуальных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным методом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных антигенов.Иммунофлуоресцентное окрашивание применяется также для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление недавно рассмотрено в исчерпывающих обзорах, а конкретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале описаны в работе Гарднера и др. Иммунофлуоресценция - более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем непосредственное выделение вируса, поскольку в период реконвалесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные клетки бывают покрыты противовирусными антителами.Непрямая иммунофлуоресценция более чувствительна, чем прямая, однако при ее использовании возникает проблема неспецифической флуоресценции. Ее можно устранить предварительным истощением антисыворотки и антииммуноглобулинового конъюгата обработанной ацетоном культурой клеток или гомогенатом печени животных. Обработка клеток ацетоном проводится следующим образом:1. 10s-109 клеток снимают со стекла и получают суспензию.2. Клетки концентрируют центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М PBS; эту процедуру повторяют трижды.3. Осадок клеток ресуспендируют: 5 мин в 10-кратном объеме ацетона и вновь осаждают клетки.4. Клетки ресуспендируют в 0,01 М PBS и проводят 6 циклов осаждения для полного удаления ацетона. После этого клетки можно хранить до употребления в 0,01 М PBS при - 20 °С.Ниже приведена стандартная методика для выявления антигенов РСВ в зараженных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции.1. В пластиковые чашки диаметром 50 мм помещают тщательно вымытые и дегидратированные этанолом покровные стекла и высевают по ЫО6 клеток BS-C-1. Инкубируют клетки 24 ч, промывают и заражают РСВ с множественностью инфекции около 1 БОЕ/кл.2. После адсорбции вируса в течение 2 ч покровные стекла с зараженными клетками тщательно промывают средой MEM, содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °С.3. Через 40-48 ч после заражения клетки фиксируют на 5 мин в охлажденном до 4°С ацетоне, высушивают на воздухе 30 мин и хранят при - 20 °С.4. Антивирусную сыворотку истощают обработанными ацетоном клетками BS-C-1 при 4°С и используют в подобранном оптимальном разведении. Кроличья сыворотка против глобулинов нескольких видов животных, конъюгированная с изотиоцианатом флуоресцеина, имеется в продаже. Конъюгат истощают обработанным ацетоном гомогенатом печени мыши или клетками BS-C-1 при 4°С.5. Покровные стекла инкубируют с антивирусной сывороткой 1 ч при 37 °С, промывают и инкубируют еще 45 мин при 37 °С с соответствующим конъюгатом.6. После промывки препараты заключают в забуференный глицерин и исследуют под флуоресцентным микроскопом. Рис.3 иллюстрирует разрешение, которое может быть получено при использовании данного метода.Доказательствами специфичности иммунофлуоресценции могут служить:1) отсутствие флуоресценции незараженных клеток BS-C-1;2) отсутствие флуоресценции при использовании ЭТС вместо специфической с зараженными РСВ клетками;3) отсутствие флуоресценции после истощения противовирусной сыворотки зараженными клетками.Высокой чувствительностью обладает и иммунопероксидазный метод; его преимущество состоит в том, что он не требует использования микроскопа с ультрафиолетовой оптикой.2.6 Твердофазный иммуноферментный анализELISA - еще один иммунологический метод быстрого обнаружения и количественного определения РСВ. Ниже приведена типичная методика.1. Лунки планшета для иммунологических реакций покрывают зараженными или незараженными клетками, или РСВ, очищенным центрифугированием в градиенте. Это делается одним из следующих методов:а) клетки выращивают в лунках планшета и через ряд заражают РСВ. Когда в лунках с зараженными клетками проявляется ЦПД, клетки промывают, фиксируют раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту, и хранят при - 20 °С;б) в лунки планшета вносят РСВ, очищенный центрифугированием в градиенте, и высушивают в течение ночи при 37°С.Если имеются клетки, персистентно инфицированные РСВ, их можно использовать в качестве источника антигена вместо литически инфицированных клеток.2. Перед началом анализа все лунки планшета покрывают 5% -ным раствором БСА в PBS. В каждый опыт следует включать негативный контроль и позитивный контроль. В лунки планшета вносят образцы вируса и инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшет промывают и добавляют овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в рекомендуемом разведении. Планшет инкубируют 1 ч при 37 °С, промывают, добавляют субстрат, о-фенилендиамин, и инкубируют при 37 °С еще 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 4,5 М H2SO4 и учитывают результаты с помощью ридера "Мультискан".Хиерхольцер и др. описали методику, позволяющую с помощью ELISA количественно выявлять белковые полосы после электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны, так называемый метод "вестерн-блотинга". Преимущество этого метода состоит в том, что он не требует использования радиоактивных изотопов. 3. Аналитические методы3.1 Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация3.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках1. Оптимальные условия для мечения вирусных белков достигаются при добавлении к зараженным клеткам через 18 ч после заражения актиномицина D в концентрации 2,5 мкг/мл.Белки РСВ удается эффективно пометить смесью - Meтионина и - цистеина по следующей методике.2. Через 2 ч после внесения актиномицина D культур ал ьную среду заменяют на среду, содержащую 50 мкКи/мл L--Meтионина и 25 мкКи/мл Ь--цистеина. у3. Клетки инкубируют 16 ч при 37 °С или до проявления выраженного ЦПД.4. Монослой промывают, солюбилизируют клетки и экстрагируют белки лизирующим буфером.5. После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре лизат используют для электрофореза или хранят при - 20 °С.Рис.4 иллюстрирует результаты разделения меченных - метионином белков РСВ в пластине 10% -ного полиакриламидного геля. Вирусные гликопротеины можно пометить аналогичным методом, используя в качестве метки 50 мкКи/мл - глюкозамина или - маннозы. Альтернативный метод введения метки в гликопротеины оболочки РСВ заключается в йодировании поверхности зараженных вирусом клеток лактопероксидазным методом. Белки очищенного нуклеокапсида РСВ можно йодировать с помощью хлорамина Т. 3.1.2 РадиоиммуноанализМетод прямого RIA с использованием в качестве вторых антител меченных 1251 гамма-глобулинов сыворотки козы против глобулинов мыши, а в качестве субстрата - фиксированных метанолом персистентно инфицированных РСВ клеток описан Коутом и др. .3.1.3 РадиоиммунопреципитацияРадиоиммунопреципитация проводится стандартным методом, описанным, например, Ферни и Герином и Уордом и др. Для РСВ применяют следующую методику.1. "Монослойные культуры клеток в чашках Петри диаметром 50 мм заражают РСВ с множественностью инфекции более 1 БОЕ/кл. Через определенные промежутки времени после заражения проводят импульсное мечение. Для этого культуральную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего 30 мкКи - метионина и 25 мкКи - цистеина, и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч.
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
