Эколого-физиологические особенности микроскопических грибов представителей рода Aspergillus, выделенных из разных местообитаний

Доступность и использование различных путей разложения углеводов. То, какой путь задействован, зависит от организма, среды и состояния клетки, например от активности ее ферментов. Для определения этого количественно оценивают превращения субстрата соответствующими ключевыми ферментами.

Полиолы. Многоатомные спирты (полиолы), например маннит, рибит, глицерин, - результат окисления глюкозо-фосфата или соответствующих предшественников, конкурентного глюконеогенезу, спиртовому брожению или полному окислению в ЦЛК, а также синтезу макромолекул или другим реакциям с использованием АТФ и восстановлением НАДФ. Возможно, полиолы вместе с трегалозой служат у грибов формой транспорта углерода в гифах; они способны регулировать восстановительную силу, энергоснабжение, осмотические условия, содержание запасных веществ и рост. Некоторые авторы считают состав полиолов у грибов важным таксономическим признаком: у хитридиомицетов, аскомицетов, базидиомицетов и дейтеромицетов преобладает маннит, у зигомицетов его нет или же он не относится к главным компонентам; в целом у грибоподобных протистов полиолов меньше, чем у настоящих грибов. Наряду с такими наиболее частыми многоатомными спиртами, как глицерин (почти у всех) и манит (у всех грибов, кроме ряда зигомицетов), обнаружены также эритрит, рибит и арабит, известные и у водорослей. Концентрация рибита у Mucorales (Zygomycetes) зависит от питания (рост при потреблении рибозы). Арабит в крови человека указывает на грибную инфекцию (например, поражение Candida albicans); у здоровых людей он отсутствует. Здесь также выделяются оомицеты, у которых не обнаружено никаких полиолов; некоторые другие группы низших грибов (грибоподобных протистов) до сих пор изучены в этом плане недостаточно (Мюллер, 1995).

Плесневые грибы в качестве источника углерода могут использовать такие трудноразлагаемые вещества, как целлюлоза, крахмал, лигнин, пектиновые вещества, нефть, пестициды.

Разложение целлюлозы. Основными источниками целлюлозы для грибов в природных условиях служат древесина и различные растительные остатки. Среди микроскопических грибов, разлагающих целлюлозу известны представители следующих родов: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticillium. Но только некоторые из них продуцируют полные внеклеточные целлюлолитические системы (эндо- и экзоглюканазы ?-глюкозидазу). Среди них Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium funiculosum, Fusarium solani. Для культуральной жидкости большинства других грибов этой группы характерно отсутствие экзоглюканазы, то есть эти грибы могут деградировать более аморфные формы целлюлозы.

Деградация высокоупорядоченной формы целлюлозы осуществляется благодаря синергическому действию комплекса целлюлолитических ферментов. При любой комбинации экзо- и эндоглюканаз Trichoderma koningii, Fusarium solani, Penicillium и Funiculosum отмечается выраженный синергизм. Однако синергизм между экзоглюканазами этих грибов и эндоглюканазами грибов, не продуцирующих экзоглюканазу (Myrothecium verrucaria), не выявлен. Нет также синергизма между экзоглюканазами грибов и эндоглюканазами рубцовых бактерий. Последнее указывает на существенные различия целлюлолитических систем грибов и бактерий (Марьиновская, 2006).

Целлюлоза является линейным полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в молекуле клетчатки, как и в молекуле целлобиозы связаны ?-гликозидной связью. Поэтому клетчатку можно рассматривать как полимер целлобиозы. Нормэн и Фуллер (1942) считают, что большинство грибов способно усваивать клетчатку. Несмотря на то, что использование клетчатки грибами имеет большое значение в круговороте веществ в природе, процесс этот изучен далеко не полно.

Обычно считают, что первым этапом использования целлюлозы грибами является ее гидролиз. Гидролиз целлюлозы можно схематически представить следующим образом: целлюлоза > целлодекстрины > целлотетроза > целлобиоза > d-глюкоза. Известен штамм Aspergillus oryzae, выделяющий целлюлазу и целлобиозу (Лилли, 1957).

Разложение крахмала. Как и целлюлоза, крахмал является полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в его молекуле соединены между собой ?-гликозидной связью, поэтому основной структурной единицей молекулы крахмала, как и молекулы гликогена, следует считать мальтозу. Зеленые растения синтезируют крахмал, животные и грибы образуют гликоген. Ферментативный гидролиз крахмала может быть схематически представлен следующим образом: крахмал>декстрины>мальтоза>d-глюкоза. Декстрины, имеющие разветвленную углеродную цепочку, лишь частично гидролизуются амилазой. Декстрины с неразветвленной углеродной цепочкой полностью превращаются в мальтозу (Мирчинк, 1988).

Крахмал нерастворим в воде. Лишь грибы, образующие амилазу, обладают способностью усваивать крахмал. Существует немало грибов, неспособных развиваться на средах с крахмалом, однако большинство из них может усваивать этот полисахарид. Было установлено, что 26 различных изученных видов и штаммов оомицетов из числа сапролегниевых усваивали как крахмал, так и продукты его гидролиза (декстрины, мальтозу и глюкозу), но не были способны ассимилировать 13 других источников углерода, включая сюда и фруктозу. Позднее А.С. Марголин (1942) показал, что 19 из 21 вида грибов, усваивающих мальтозу, обладали также способностью использовать и декстрин (Лилли, 1957).

Разложение пектиновых веществ. Среди грибов имеются активные разлагатели пектина, который является существенным компонентом растительного опада. Пектин образует в растениях межклеточное вещество, из которого состоят так называемые срединные пластинки, соединяющие между собой отдельные клетки растения. Они придают тканям прочность. Пектин представляет собой высокомолекулярное соединение углеводной природы - полисахарид, в котором метоксилированные остатки галактуроновой кислоты связаны между собой ?-1,4-глюкозидными связями.

Многие грибы образуют пектинолитические ферменты. Высокая пектинолитическая активность обнаружена у некоторых эпифитных грибов, главным образом Aureobasidium pullulans и видов Cladosporium. Пектинолитические грибы занимают значительное место среди типичных представителей лесной подстилки - это виды родов Cladosporium, Alternaria, Aposphaeria, Penicillium, фитопатогенные грибы родов Fusarium, Verticillium, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum.

Ферментативное разрушение пектиновых веществ в растениях имеет значение в патогенезе некоторых заболеваний. Фитопатогенные грибы разрушают пектин срединной пластинкой и пектаты в первичных клеточных оболочках, что приводит к изменению их физико-химических свойств и создает условия для внедрения паразита, а также в результате действия пектинэстеразы образуются вещества - полигалактурониды, способные закупоривать сосуды, что в конечном итоге приводит к увяданию растений.

Существенное значение разрушения пектиновых веществ грибами имеет при разложении растительного опада. Практическое использование пектиназ грибов - применение в пищевой промышленности при приготовлении фруктовых соков для их осветления, а также при мочке льна (Мирчинк, 1988).

Участвуя в разложении многих углеродсодержащих веществ растительного опада и древесины в первую очередь трудноразлагаемых полимерных соединений, где грибам принадлежит ведущая роль, они занимают значительное место в круговороте углерода, являясь поставщиками СО2 в атмосферу.

Среди грибов есть организмы, разлагающие жиры и воска, входящие в состав растительных и животных тканей. Это определяется наличием у них ферментов липаз. Наибольшей активностью липолитических ферментов обладают виды Mucor lipolyticus, Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Penicillium verrusum, Penicillium roquefortii. Многие выделены с поверхности растений, являясь эпифитами и способны разлагать также восковые налеты на поверхности растений.

Известна также способность грибов разлагать как алифатические, так и ароматические углеводороды. В этом отношении наибольшей активностью характеризуются грибы рода Aspergillus (Мирчинк, 1988).

Разрушение грибами нефтепродуктов. В последние десятилетия в связи с возродившимся интересом к процессам микробного превращения углеводородов были обнаружены мицелиальные грибы, деятельность которых приводит к деструкции нефти и ее производных. В настоящее время доказано, что утилизировать нефтепродукты, в том числе различные топлива, во время хранения и транспортировки способны многие виды грибов и бактерий (Андреюк, 1980).

Нефтепродукты как среда обитания грибов характеризуются рядом особенностей: 1) содержат большое количество сравнительно доступного углерода и минимальное - азота при почти недоступном пространственном расположении его в молекуле; 2) в них почти отсутствует доступная активная вода. Это оказывает существенное влияние на синтез de novo грибной клетки.

Вопросы необходимого соотношения C:N у грибов при росте на нефтепродуктах в биохимическом аспекте исследованы еще мало и уровень этих данных уже не отвечает современным представлениям о возможностях грибной клетки. Очевидно, здесь имеет место не только типичный гетеротрофный процесс, но также определенное подобие хемотрофии и автотрофии, причем стадии роста отличаются и специфичны по способности к разным типам трофики. Особенно это проявляется в период формирования репродуктивных структур (Ниязова, 1982; Бабьева, 1983). Спецификой роста грибов на нефтепродуктах является их способность распространяться на поверхности, то есть возможность использовать при этом активную воду из воздуха, а также расти в толще нефтепродуктов, то есть ограничивать свои потребности в воде за счет активной воды самих нефтепродуктов (Евдокимова 1982).

Рост грибов (кладоспориев, пенициллиев, аспергиллов и некоторых других видов и штаммов) в разных нефтепродуктах характеризуется различным типом размещения мицелиальной пленки. Наиболее типичный - на разделе фаз, однако чаще всего наблюдается еще и глубинный рост, при котором развивается не только в толще жидкости - до 20 см. Причем интересно, что рост этих штаммов при определенном соотношении нефтепродуктов и воды мало зависит от высоты слоев смеси, а также воздуха в надсубстратном пространстве. Это свидетельствует о большой возможности мицелиальных грибов выдерживать жесткие условия и приспосабливаться к потреблению необходимых для метаболизма веществ не совсем обычными биохимическими и физиологическими путями.

В настоящее время установлено, что способность окислять углеводороды нефти не является специфической чертой отдельных видов грибов. Это не редкая их особенность, а одна из физиологических функций. Однако, несмотря на большое сходство химических и физических свойств фракций нефтепродуктов, у большинства видов грибов четко проявляется избирательное отношение к их утилизации (Бабьева, 1983).

Разрушение полимерных материалов. Синтез полимеров и создание на их основе материалов, обладающих повышенной стойкостью к факторам окружающей среды и воздействию различных организмов, привел к обострению экологической обстановки из-за накопления больших объемов отходов, содержащих эти соединения в разных отраслях промышленности. В последние десятилетия во многих странах уделяется большое внимание созданию полимерных материалов и их модификаций, утилизация которых возможна под воздействием микробиоты. В качестве добавок к пластификаторам исследователи используют природные компоненты такие, как крахмал, производные целлюлозы, протеин, хитозан и так далее. На основе этих композитных полимеров ряд фирм выпускает пластики для производства изделий разового пользования, упаковки пищевых продуктов, плоских пленок и так далее, которые обладают способностью к биодеградации при компостировании и так далее (Власова, 2001; Фомин, 2001). Состав микроорганизмов, контаминирующих техногенные материалы и способных вызывать их биодеградацию, очень разнообразен как в таксономическом отношении, так и по их физиолого-биохимической активности. Среди них ведущее место занимают представители дейтеромицетов, способные развиваться на обширном сортименте материалов, содержащих соединения как природного происхождения, так и искусственного синтеза (Биоповреждения, 1987; Коваль, 1989).

Было проведено исследование О.В. Сычуговой с соавторами (2003) с целью изучения возможности роста и развития видов микромицетов на композиции пленочного сополимера этилена и винилацетата с термопластичным крахмалом.

В процессе данного исследования оценка возможности потребления разных форм крахмала тест - культурами показала, что они способны утилизировать данный источник углеродного питания. Однако динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, при одной и той же навеске крахмала не одинакова, что особенно четко проявляется на 4-10-е сутки. Выявляется и некоторая разница в темпе роста видов грибов на нативном и растворимом крахмале разного происхождения, а также на средах Чапека и Гетченсона, взятых в качестве контроля (Сычугова, 2003).

Изменения морфологических признаков и образования новых структур у тест - культур на модифицированных средах при замене сахарозы на крахмал и росте на полимере не отмечаются, и они сопоставимы с параметрами, приведенными в определителях (Пидопличко, 1953; Ellis, 1971; Watanabe, 2000). Отличия выявлены у них только в темпах формирования морфологических структур. Хотя в литературе и приведены данные о влиянии субстрата на появление новых морфологических структур у грибов (Богомолова, 2001), однако, вероятнее всего, онтогенез и темпы развития определяются геномом вида, реализация программы которого зависит от влияния различных факторов (Шевцова, 1987; Долгова, 1997).

На поверхности пленки, содержащей термопластичный крахмал фиксируются сформированные пучки конидиеносцев Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Penicillium funiculosum, Chaetomium globosum, Trichoderma viride. Другие виды из взятого набора тест-культур не растут на данном субстрате или формируют слабое спороношение и в более поздние сроки.

Рост мицелия и формирование спороношения на композиции пленочного сополимера дает основание предполагать участие некоторых видов грибов в биодеструкции полимера из сополимеров этилена и винилацетата (СЭВА) с добавлением термопластичного крахмала (ТПК). Это дает возможность при последующих пересевах на смесях СЭВА и ТПК отобрать наиболее активные виды и их штаммы для разработки биотехнологии по его утилизации (Сычугова, 2003).

Таким образом, микроскопические грибы могут использовать в качестве источников углерода разнообразные органические вещества, тем самым являясь важными деструкторами различных природных материалов: целлюлозы, крахмала, лигнина, гемицеллюлозы, жиров, углеводородов, а также синтетических материалов, таких как пластики, пленки, упаковки пищевых продуктов и так далее.

2. Объекты и методы исследований

В качестве объектов исследования были выбраны различные виды микроскопических грибов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus. Культуры были взяты из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ. Данные виды микромицетов были выделены из основных типов почв Астраханской области.

В качестве источника углерода были выбраны из легкоусвояемых - сахара: сахароза, арабиноза, ксилоза, галактоза, лактоза и мальтоза; многоатомные спирты: глицерин, сорбит, маннит; а также из полисахаридов - крахмал. Все эти источники были взяты из коллекции химических реактивов кафедры. Из трудноразлагаемых источников углерода были использованы: нефть, целлюлоза, гербицид и пестицид. Целлюлозу добавляли в среду в виде мелко нарезанной фильтровальной бумаги. Для определения способности микроскопических грибов рода Aspergillus использовать в качестве единственного источника углерода гербициды в данной работе использовали гербицид «Пиримифос-метил» или О, О-диметил-О - (2-диэтиламино-6-метилпиримидил-4) тиофосфат - это жидкость соломенного цвета, практически не растворим в воде, хорошо растворим во многих органических растворителях, неустойчив в кислой и щелочной средах, является эффективным средством для борьбы со многими насекомыми и клещами. Для определения способности микромицетов рода Aspergillus использовать пестициды в качестве источника углерода применяли дуст. Сахара, крахмал и многоатомные спирты добавлялись в среды в количестве 30 г./л, нефть - 30 мл/л, целлюлоза - 10 г./л, гербицид - 0,25 мл/л и пестицид - 0,001 г./л.

При составлении питательных сред для грибов обычно пользуются результатами предварительных исследований по выяснению значения для роста и развития изучаемого объекта концентрации отдельных компонентов (источников углерода, азота, зольных веществ и витаминов).

Основными правилами, которых придерживаются при составлении сред, способствующих росту грибов, являются следующие:

1) целесообразно применять отдельные источники углерода и азота;

2) концентрация вещества, служащего источником азотного питания, должна сильно уступать концентрации вещества - источника углерода (примерно в 10 - 15 раз).

Хотя среды натурального происхождения более благоприятны для роста большинства грибов, однако при физиологических экспериментах по изучению развития и обмена у грибов использовать их нежелательно, так как их состав непостоянен. Для этих экспериментов обычно используются синтетические среды. Одной из первых синтетических сред для грибов (культур видов аспергиллов и пенициллов) была среда Роллена следующего состава (г/л):

сахароза - 72 (около 5%);

винная кислота - 4 (для подкисления среды);

фосфорнокислый аммоний - 4;

углекислый калий - 0,6;

сернокислый аммоний - 0,25;

сернокислый цинк - 0,07;

сернокислое железо - 0,07;

кремнекислый калий - 0,07;

дистиллированная вода - 1500 мл.

Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):

сахароза - 30;

NaNO3 - 2;

MgSO4 - 0,5;

FeSO4 - 0,01;

KH2PO4 - 1;

KCl - 0,5;

дистиллированная вода - 1000 мл.

Для многих грибов среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов - дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов - паразитов растений - ткани растения - хозяина; выращивание грибов - копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 100 мл, рассчитанной на 5 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм. и 120 _С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.

Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека с различными источниками углерода и среду Частухина (для целлюлозоразрушающих грибов). Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования - 25±2 _С. Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.

Для определения способности микромицетов использовать различные источники углерода применяют и другие методики.

Например, многие микромицеты могут использовать в качестве единственного источника углерода органические кислоты. Для определения способности расти на средах с органическими кислотами рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH4)2HPO4 - 0,5; MgSO4*7H2O - 0,2; NaCl - 0,1; агар - 15,0; органическая кислота в виде соли Na или К - 2,0; pH 6,8. До стерилизации к среде добавляют 20 мл 0,04% водного раствора индикатора метилрот, который в интервале pH 6,8 - 8,4 изменяет окраску от желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельствует рост по уколу и изменение кислотности среды в щелочную сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.

Некоторые грибы способны использовать и такие химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углеводороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO3 - 4,0; KH2PO4 - 0,6; Na2HPO4*12H2O - 1,4; MgSO4*7H2O - 0,8; выщелоченный агар - 2,0; pH 7,2. Среду стерилизуют в колбах при 1 атм. и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку. Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диаметр 8-10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени горелки. Микромицеты высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. В лунку вносят 2-3 капли исследуемого углеводорода (стерилизуют фильтрованием). Чашки помещают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7-10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем - ростом на среде без углеводорода (Нетрусов, 2005).

Страницы: 1, 2, 3