Вікові особливості вільнорадикального окислення білків і ліпідів у мозку щурів з гіпотиреозом і вплив на них інтенсивного фізичного навантаження

Вікові особливості вільнорадикального окислення білків і ліпідів у мозку щурів з гіпотиреозом і вплив на них інтенсивного фізичного навантаження

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. КАРАЗіНА

ХАДДАД АЙХАМ АЛІ

УДК: 616.441 - 008.64:612.66

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ Вільнорадикального ОКИСЛЕННЯ БІЛКІВ І ЛІПІДІВ У МОЗКУ Щурів З ГІПОТИРЕОЗОМ І ВПЛИВ НА НИХ ІНТЕНСИВНОГО ФІЗИЧНОГО НАВАНТАЖЕННЯ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Давидов Вадим В'ячеславович, Харківська медична академія післядипломної освіти Міністерства охорони здоров'я України, професор кафедри клінічної біохімії і судово-медичної токсикології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Бабенко Наталія Олексіївна, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України, НДІ біології, завідувач відділу фізіології онтогенезу доктор біологічних наук, професор. Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Захист відбудеться 18.06.2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розісланий 17.05. 2008 року

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Дзюба В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У цей час серед населення різних країн світу й, у тому числі України, має місце підвищення рівня захворюваності гіпотиреозом (Караченцев Ю.И. і співавт., 2002, 2004; Caparevic Z. et al., 2003; Караченцева И.Н., 2006; Monzani F. et al., 2006). Особливу небезпеку гіпотиреоз становить у ранньому дитячому й підлітковому віці. Це пов'язане з високим ризиком появи в дітей і підлітків глибоких порушень із боку центральної нервової системи, а також виникненням серйозних ускладнень у більш зрілому віці, у випадку несвоєчасної діагностики даного захворювання (Зефирова Г.С., 1999; Браверман Л.Е., 2000). Серед різноманітних проявів гіпотиреозу широке поширення має ураження ЦНС, що проявляється у виникненні невротичних розладів (Larsen P.R., 1996; Зефирова Г.С., 1999). Механізм їхнього виникнення при гіпотиреозі дотепер не вивчений. Разом з тим, поява центральних порушень припускає модуляцію інтегративної функції мозку в організмі й, тим самим, сприяє порушенню функціонування інших внутрішніх органів і систем органів, що у свою чергу, визначає велику клінічну симптоматику даного захворювання (Зефирова Г.С., 1999; Браверман Л.Е., 2000).

Відповідно до сучасних уявлень, у ролі неспецифічної ланки розвитку численних фізіологічних станів і патологічних процесів виступає оксидативний стрес (Mazzetti I. et al., 2001; Cooper C.E. et al., 2002; Ofran H. et al., 2004; Nayanatara A.K. et al., 2005; Dmitriev L.F., 2007; Lovel M.A. et al., 2007; Pittagula M. et al., 2006; Flora S.J., 2007). Разом з тим, відомості про стан вільнорадикальних процесів у головному мозку при гіпотиреозі відрізняються суперечливістю (Venditti P. et al., 1997; Gredilla R. et al., 2001; Varghese S. et al., 2001; Brzezinska-Slebodzinska E., 2005). Усе вище викладене визначає високу актуальність дослідження вільнорадикальних процесів у мозку при гіпотиреозі. Всебічне вивчення цього питання відкриває перспективи в пізнанні механізмів розвитку даного захворювання, а також розробці нових підходів до його лікування й профілактики.

Беручи до уваги сучасні уявлення про фізіологічну роль оксидативного стресу і його участі у формуванні адаптивних реакцій в організмі (Vendemiale G. et al., 1999; Schoneich C. et al., 2006), великий інтерес становить також і з'ясування ефекту прооксидантних факторів на стан вільнорадикальних процесів у мозку при гіпотиреозі. Подібні фактори проявляються в організмі в умовах впливу на нього стресорів різної природи, і, у тому числі, при інтенсивному фізичному навантаженні (ІФН) (Leeuwenburgh C. et al., 2001; Sureda A. et al., 2005; Pittagula M. et al., 2006). Зміна ефекту прооксидантних факторів на стан вільнорадикальних процесів у клітинах, сприяє модуляції їхньої стійкості до несприятливих

зовнішніх впливів. У цьому зв'язку, новим перспективним напрямком у з'ясуванні причин формування невротичних розладів при гіпотиреозі, є вивчення за його наявності особливостей реалізації прооксидантної дії ІФН на мозок.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках держбюджетної теми “Вивчити вікові особливості метаболічної адаптації до дії ушкоджуючих факторів окисного стресу“ (N державної реєстрації 0102U002283).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення вікових особливостей формування оксидативного стресу в великих півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом і з'ясування впливу на них інтенсивного фізичного навантаження.

Для реалізації поставленої мети були визначені наступні завдання:

У мітохондріальній, мікросомальній і постмітохондріальній фракції великих півкуль головного мозку в дорослих статевозрілих (12-ти місячних) щурів і тварин пубертатного віку (1,5-місячних) з експериментальним гіпотиреозом після ІФН і без нього:

Визначити особливості накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків;

Оцінити ефективність функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту;

Вивчити швидкість індукованого перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) й вільнорадикального окислення білків.

Об'єкт дослідження - вільнорадикальні процеси й ферменти першої лінії антиоксидантного захисту в мозку при експериментальному гіпотиреозі в щурів різного віку в нормі й при інтенсивному фізичному навантаженні.

Предмет дослідження - рівень накопичення продуктів вільнорадикального окислення білків і ліпідів, швидкість індукованого вільнорадикального окислення білків і ліпідів, активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в субклітинних фракціях великих півкуль головного мозку.

Методи дослідження - спектрофотометрія у видимій і ближній ультрафіолетовій зоні спектра (визначення активності ферментів і вмісту продуктів вільнорадикального окислення); спектрофлюорометрія (вимір концентрації основ Шиффа); диференціальне центрифугування (фракціонування гомогенатів півкуль головного мозку), імуноферментний аналіз (визначення вмісту гормонів щитовидної залози й тиреотропного гормону в крові), статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів визначається тим, що в дисертаційній роботі вперше встановлені вікові особливості використання ліпідів і білків субклітинних фракцій великих півкуль головного мозку в процесах вільнорадикального окислення, а також зміни у цих процесах у щурів з експериментальним гіпотиреозом, що піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню й без нього. Показано, що в мозку дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку при гіпотиреозі формується стан оксидативного стресу. Це зрушення має неспецифічний характер і в більшій мірі проявляється в дорослих щурів.

Важливу роль у виникненні оксидативного стресу в мозку щурів з гіпотиреозом відіграє підвищення інтенсивності процесів радикалоутворення в мітохондріях. Воно не пов'язане зі зміною стану в них ферментативної системи першої лінії антиоксидантного захисту. Більше того, характер зрушень із боку активності каталази й супероксиддисмутази (СОД), що виникають у дорослих щурів при експериментальному гіпотиреозі, припускає формування умов для підвищення ефективності функціонування першої лінії антиоксидантного захисту й, тим самим, обмежують ефект посиленого радикалоутворення в мітохондріях при оксидативному стресі.

Особливе значення у виникненні оксидативного стресу в мозку дорослих щурів при гіпотиреозі, здобуває підвищення чутливості мембран мікросом до дії прооксидантів. Подібне зрушення не характерне для тварин пубертатного віку, тому що ліпіди й білки досліджених субклітинних фракцій мозку в них проявляють підвищену стійкість до вільнорадикального окислення, навіть в умовах додаткового прооксидантного впливу ІФН.

Виявлено, що в дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку з експериментальним гіпотиреозом обмежений прояв прооксидантної дії на мозок інтенсивного фізичного навантаження. В основі формування цього зрушення лежить компенсаторне підвищення ефективності функціонування систем антиоксидантного захисту в мітохондріях мозку в умовах недостатності щитовидної залози. Виникнення оксидативного стресу в мозку й обмеження ефективності впливу на нього прооксидантних факторів, визначають появу функціональних порушень із боку ЦНС при гіпотиреозі.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють сучасну уяву про особливості вільнорадикального окислення ліпідів і білків субклітинних фракцій мозку в умовах впливу на організм несприятливих зовнішніх факторів. Вони розкривають механізми виникнення порушень із боку ЦНС при гіпотиреозі й указують на існування вікових особливостей їхньої появи в періоді статевого дозрівання. Результати проведених досліджень створюють теоретичні передумови для розробки нових підходів до лікування й профілактики порушень із боку ЦНС при захворюваннях, пов'язаних з недостатністю щитовидної залози, спрямованих на нормалізацію в ній стану вільнорадикальних процесів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконане під керівництвом доктора медичних наук, професора В.В. Давидова, з яким автор має загальні публікації. Результати, представлені в рукопису, отримані автором самостійно. Дисертантом особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка й аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлені на міжнародній науковій конференції студентів і молодих учених “Актуальні питання в сучасній медицині” (Харків, 2007); конференції молодих учених, присвяченої пам'яті професора В.П. Вендета “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2007” (Київ, 2007); міжнародної науково-практичної конференції ”Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества“ (Курск, 2007); на 5-й національній науково-практичній конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск, 2007); на науково-практичній конференції ”Внесок молодих учених у розвиток медичної науки й практики” (Харків, 2007); на ІІ Міжнародній конференції молодих учених “Биология: От молекулы до биосферы” (Харьков, 2007 г.); на науково-практичній конференції молодих учених: “Медична наука: сучасні досягнення й інновації” (Харків, 2007); на науково-практичній конференції з міжнародною участю: “Ендокринна патологія у віковому аспекті ” (Харків, 2007).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в 11 наукових публікаціях - 4 статтях у журналах, рекомендованих ВАК України й 7 - у збірках тез доповідей конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Робота викладена на 189 сторінках машинописного тексту й складається із вступу, огляду літератури, методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків і списку цитованої літератури, що включає 280 найменувань. Робота ілюстрована 16 таблицями й 23 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить аналіз сучасного стану питання про молекулярні механізми формування оксидативного стресу і його значення в адаптації організму до несприятливих зовнішніх впливів і розвитку патологічних процесів. Особлива увага приділяється розгляду даних літератури про особливості перебігу вільнорадикальних процесів у тканинах внутрішніх органів при гіпотиреозі й інтенсивному фізичному навантаженню.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження виконане на 144 щурах-самцях лінії Вістар, які втримувалися в умовах віварію Харківської медичної академії післядипломної освіти й забезпечувалися стандартним раціоном харчування. Тварин ділили на дві вікові групи: дорослі статевозрілі - 10 - 12 місяців (маса 240 - 360 г) і молоді, що перебувають у періоді статевого дозрівання - 1,5 місяця (маса 80- 90 г). Кожну групу ділили на чотири підгрупи: 1 - інтактні, 2 - щури, які піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню (плаванню до “відмови”), 3 - тварини, у яких відтворювався експериментальний гіпотиреоз, 4 - щури з експериментальним гіпотиреозом, яких піддавали інтенсивному фізичному навантаженню.

Для відтворення експериментального гіпотиреозу тваринам внутрішньоочеревинно вводився антитиреоїдний препарат мерказоліл з розрахунку 1 мг препарату на 100 г маси тварини. Препарат розчинявся в ізотонічному розчині хлористого натрію. Введення проводилося щодня протягом 15 днів (Krasilnikova O.A. et al., 2002).

Ефективність відтворення експериментального гіпотиреозу контролювалася шляхом визначення в крові концентрації тиреоїдних гормонів (тироксину, трийодотироніну) і тиреотропіну. Дослідження проводилися з використанням наборів для імуноферментних досліджень фірми “DAI” (США) на імуноферментному аналізаторі “HUMAREADER” (Німеччина).

З метою відтворення моделі інтенсивного фізичного навантаження щури піддавалися плаванню до “відмови” у круглих пластикових ємностях діаметром 40 см. Через годину після плавання тварини піддавалися евтаназії, відповідно до умов евтаназії, зазначених в методичних рекомендаціях МОЗ України та загальних етичних принципів проведення експериментів на тваринах, узгоджених з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей”.

З півкуль головного мозку за допомогою скляного гомогенізатора Поттера-Ельвегейма готувалися 10 % гомогенати на 0,32 М сахарозі (рН 7,4). Отримані гомогенати піддавалися фракціонуванню за допомогою методу диференціального центрифугування з метою одержання мітохондріальної, мікросомальної і постмітохондріальної фракцій.

У субклітинних фракціях півкуль головного мозку проводилося визначення концентрації карбонільованих білків і продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (основ Шиффа і дієнових кон'югатів). Вимір вмісту карбонільованих білків (КБ) проводився за методом Дубиніної Є.Є. (2000). У розрахунках використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,1 . 104 М-1 . см-1. Визначення основ Шиффа (ШО) проводилося за допомогою флюорометричного методу (Rice-Evans C.A. et al., 1991). В основу виміру концентрації дієнових кон'югатів (ДК) був покладений спектрофотометричний метод Стальної І.Д. (1977). При розрахунках змісту дієнових кон'югатів використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,2 . 105 М-1 . см-1. .

У мітохондріальній і мікросомальній фракції півкуль головного мозку досліджувалася швидкість індукованого ПОЛ та індукованого вільнорадикального окислення білків. Для цього 0,1 мл досліджуваної проби субклітинної фракції змішували з 1,5 мл 0,015 М фосфатного буфера (рН 7,4). Після трихвилинної преінкубації при 37 °С, у реакційну суміш вносили 0,2 мл 0,01 М солі Мора й 0,2 мл 1 М перекису водню. Проби інтенсивно перемішували й інкубували протягом 10 хвилин при 37 °С. Після цього реакція зупинялася за допомогою додавання трихлоруксусної кислоти до кінцевої концентрації 5 %. Проби центрифугували 15 хвилин при 3000 об/хв. В отриманому в такий спосіб осаді вимірювали вміст карбонільованих білків (Дубиніна Є.Є., 2000), а в супернатанті - ТБК-реактивних речовин. Визначення концентрації ТБК-реактивних речовин проводилося по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. У розрахунках використовували коефіцієнт молярної екстинкції малонового діальдегіду, що відповідає 1,53 . 105 М-1 . см-1 (Esterbauer H. et al., 1990).

Для оцінки стану першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях півкуль головного мозку вимірялася активність каталази (Барабой В.А. й ін., 1991) і супероксиддисмутази (Костюк В.А., 1990).

Вимір вмісту білка в аналізованих пробах визначали за Lowry O. et al. (1955).

Отримані результати піддавалися статистичній обробці з використанням непараметричного методу Wilcoxon-Mann-Whitney. Розходження між даними вважалися достовірними при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведені дослідження показали, що в мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом виникає стан оксидативного стресу. Його проявом служить накопичення в них у мітохондріальній і мікросомальній фракції великих півкуль головного мозку продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків (табл. 1 і 2).

Підвищення інтенсивності вільнорадикального окислення ліпідів у мікросомальній фракції мозку в щурів з гіпотиреозом супроводжується збільшенням у ній вмісту дієнових кон'югатів, при відсутності накопичення основ Шиффа. При цьому виникає підвищення індексу співвідношення ДК/ШО в мікросомах мозку щурів обох вікових груп, порівняно з його вихідною величиною (рис. 1).

Таблиця 1

Вміст продуктів ПОЛ у субклітинних фракціях великих півкуль головного мозку інтактних щурів і тварин з експериментальним гіпотиреозом (M + m; n = 5 - 6)

Примітки: * - Р< 0,05 порівняно з інтактними; ** - Р< 0,05 порівняно з інтактними 1,5-місячними.

Виникнення подібного зрушення в співвідношенні початкових і кінцевих продуктів ПОЛ, може бути пов'язане зі зміною переважних шляхів метаболізму проміжних продуктів вільнорадикального окислення ліпідів, до числа яких можна віднести численні карбонільні сполуки й, у тому числі, ендогенні альдегіди. В умовах стимуляції перекісного окислення ліпідів у мікросомах це зрушення здобуває адаптивного значення, спрямованого на обмеження ушкоджуючої дії оксидативного стресу (Davydov V.V. et al., 2004).

Таблиця 2

Вміст карбонільованих білків (нмоль/мг білка) у субклітинних фракціях мозку інтактних щурів і тварин з експериментальним гіпотиреозом (M + m; n = 5 - 6)

Примітки: 1) КБ363 - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 363 нм; КБ370 - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 370 нм;

2) * - Р< 0,05 порівняно з інтактними; ** - Р< 0,05 порівняно з інтактними 1,5-місячними.

Рис. 1. Величина співвідношення ДК/ШО в мікросомальній фракції півкуль головного мозку 1,5- (світлі стовпчики) і 12-ти місячних - (темні стовпчики) щурів з експериментальним гіпотиреозом. Примітка. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними.

Отримані дані про виникнення оксидативного стресу в півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом відповідають відомостям інших авторів (Das K. et al., 2004). Разом з тим, у цьому дослідженні вперше встановлений факт існування характерних вікових рис у прояві оксидативного стресу в мозку при досліджуваній патології. Основним їхнім проявом є більша виразність оксидативного стресу при гіпотиреозі в мозку в дорослих статевозрілих тварин, ніж у щурів у періоді статевого дозрівання. Підтвердженням цього є дані про неоднаковий рівень накопичення в щурів у субклітинних фракціях півкуль головного мозку продуктів вільнорадикального окислення. В мітохондріях мозку в дорослих щурів з гіпотиреозом відбувається збільшення концентрації ДК, ШО й карбонільованих білків на 133, 55 і 91 % відповідно, у порівнянні з їхнім вихідним рівнем (табл. 1). У той же час у тварин пубертатного віку відбувається тільки підвищення концентрації карбонільованих білків на 76 % порівняно з інтактними щурами цієї вікової групи (табл. 2). Причому, у мітохондріях мозку дорослих тварин і щурів пубертатного віку накопичуються різні фракції карбонільованих білків: в 12-ти місячних - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 370 нм (КБ370) , а в 1,5-місячних - при 363 нм відповідно (КБ363). Виникаюче зрушення обумовлює появу в них різноспрямованих змін з боку індексу співвідношення КБ363/КБ370 у мітохондріальній фракції мозку.

Страницы: 1, 2