Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе

Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе

Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В.Г. Белинского

Факультет

Естественно-географический

АД - артериальное давление

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЭМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

кбз- - карбобензокси-

КПN - карбоксипептидаза N

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПВДС (ДСИП) - пептид, вызывающий дельта сон (дельта-сон индуцирующий пептид

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЭБС - эмоционально-болевой стресс

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время в биохимии спорта огромное внимание уделяется поиску тех ключевых факторов регуляции метаболизма, воздействие на которые позволит значительно улучшить спортивный результат. Наиболее перспективной мишенью для воздействия является пептидергическая система. Нейропептиды играют важную роль в адаптационных процессах, участвуют в формировании пищедобывательного и полового поведения, регулируют состояние иммунной системы [2]. Многие из этих веществ вовлекаются в регуляцию полового созревания, влияют на половую дифференциацию организма, на процессы внимания и памяти, на эмоциональное поведение, обладают анальгезирующим действием. Данные исследований последних лет свидетельствуют об участии некоторых регуляторных пептидов в реакциях адаптации при физической работе. Однако, ограничения, связанные с трудностью введения регуляторных пептидов в организм животных, снижают возможности их использования для регуляции функционального состояния организма и улучшения спортивного результата. Кроме того, изучение содержания уровня того или иного нейропептида в тканях и сыворотке крови не дает достаточно точных представлений о динамических процессах, происходящих в пептидергической системе при физической работе. Более информативным является изучение процессов синтеза и трансформации нейропептидов, поскольку концентрация биологически активных пептидов зависит от активности ферментов, участвующих в их обмене.

Еще одним существенным недостатком имеющихся работ по изучению содержания регуляторных пептидов при физической работе является отсутствие дифференциации объектов исследования по уровню тренированности. Высокий спортивный результат могут показать небольшое количество специализированных людей-спортсменов высокой квалификации, а обычные люди повторить его не в состоянии. Биохимические изменения, которые его сопровождают, являются очень значительными и превосходят изменения, которые наблюдаются у обычных людей, не занимающихся спортом, как в количественном, так и в качественном отношениях.

Знание путей образования и инактивации регуляторных пептидов, участвующих в ответе организма на физическую нагрузку, позволит, избирательно воздействуя на ферменты их метаболизма, регулировать уровень биологических форм тех нейропептидов, от которых зависит спортивный результат.

Таким образом, целью нашей работы являлось выяснение роли пептидергической системы в адаптации к физической работе у спортсменов высокой квалификации.

При этом ставились следующие задачи:

1. Изучить уровень вещества Р, регуляторного пептида контролирующего многие адаптационные перестройки и обладающего широким спектром физиологического действия, в сыворотке крови спортсменов и не спортсменов в норме и при физической работе.

2. Изучить активность ферментов обмена регуляторных пептидов - пептидил-дипептидазы А, карбоксипептидазы N и лейцинаминопептидазы в сыворотке крови спортсменов и не спортсменов в норме и при физической работе.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые исследован уровень вещества Р и активность ферментов его обмена при физической работе. Полученные данные позволят приступить к разработке методов направленного влияния на активность ферментов обмена пептидов, участвующих в адаптации к физической работе с целью улучшения спортивного результата.

Вещество P (Substance P) - один из наиболее известных пептидов, открытый в 1931 году [42].

Вещество Р - биологически активный пептид из 11 аминокислотных остатков. Вещество Р обладает широким спектром биологической активности: оказывает сосудорасширяющее действие, способствует дегрануляции тучных клеток, является хемоаттрактантом для лейкоцитов, активирует синтез и высвобождение медиаторов воспаления. Показано, что снижение концентрации вещества Р в синовиальной жидкости уменьшает тяжесть экспериментального артрита.

Обладает широким спектром физиологической активности: изменяет артериальное давление крови, капиллярную проницаемость, сокращение гладкой мускулатуры, обладает секретогенным действием, высвобождает пролактин и пищеварительные гормоны. В последнее время интенсивно изучается роль вещества Р и его аналогов в регуляции центральных процессов - порога болевого воздействия, обучения, сна, устойчивости к стрессу. В головном мозге вещество Р участвует в процессах, связанных с функцией другого нейрорегулятора - допамина. При повреждении допаминэргических волокон выявлено снижение экспресии мРНК, кодирующих образование вещества Р, энкефалинов, динорфина. На базе основной структуры вещества Р получено большое число химических производных, которые обладают свойствами сионистов или антагонистов тахикининовых рецепторов [57].

Вещество Р присутствует во многих специфических нейронных путях в головном мозгу, а также в первичных сенсорных волокнах периферических нервов. Некоторые из этих сенсорных нейронов, тела которых лежат в сенсорных ганглиях по обе стороны спинного мозга, содержат вещество Р и выделяют его из своих аксонных окончаний в синапсах со спинальными нейронами. Поскольку вещество Р возбуждает те спинальные нейроны, которые легче всего реагируют на болевые стимулы, было высказано предположение, что оно служит сенсорным медиатором, специфически связанным с передачей информации о боли от периферических болевых рецепторов в центральную нервную систему.

Морфиноподобный пептид энкефалин тоже в изобилии содержится в мелких нейронах в той части спинного мозга, куда приходят волокна, содержащие вещество Р. Энкефалин и препараты опия способны подавлять выделение вещества Р из сенсорных волокон. Поэтому нейроны, содержащие энкефалин, могут регулировать поступление болевых сигналов в головной мозг, модулируя выделение вещества Р на уровне первого переключения в центральной нервной системе. Подобные же тормозные взаимодействия возможны и на более высоких уровнях мозга. Вещество Р - не единственный предполагаемый медиатор, локализующийся, как показано, в сенсорных нейронах; к таким же идентифицированным к настоящему времени веществам относятся ангиотензин, холецистокинин, соматостатин и глутаминовая кислота. Таким образом, по мере того как все больше становится известно о сенсорных медиаторах и их модуляционных механизмах в спинном мозгу, начинает возникать картина поразительной химической сложности.

Гипотетический воротный механизм в первом синаптическом переключении, возможно, регулирует передачу информации о боли от периферических болевых рецепторов к головному мозгу. В задних рогах спинного мозга вставочные нейроны, содержащие пептидный медиатор энкефалин, образуют синапсы на аксонных окончаниях болевых нейронов, которые в качестве медиатора используют вещество Р. Выделяемый вставочными нейронами энкефалин тормозит выход этого вещества, из-за чего воспринимающий нейрон в спинном мозгу получает меньше возбуждающей стимуляции и поэтому посылает в головной мозг меньше связанных с болью импульсов. Такие опийные препараты, как морфий, по-видимому, связываются с незанятыми рецепторами энкефалина, имитируя подавление боли, производимое энкефалиновой системой.[62]

По многим функциональным признакам вещество Р следует отнести к группе тахикининов: сходный спектр физиологических функций, общая система рецепторов, родственные признаки структуры предшественников. Однако тщательное исследование функционального профиля вещества Р и успехи в множественном синтезе его аналогов позволяют условно определить его как отдельную группу [59,44,68].

В группу тахикининов (Tachykinins) входят пептиды, имеющие, как и вещество P, сходную С-концевую последовательность [-(Phe)-Gly-Leu-Met]. Сюда относятся соединения, обозначенные как нейрокинины, нейромедины, бомбезины, а также оригинальные тахикинины, обнаруживаемые у амфибий, рыб и беспозвоночных животных. Другое сходство относится к наличию общего предшественника - бета-препротахикинина.

Распределение тахикининов в тканях одного и того же организма (в первую очередь, высших позвоночных) весьма разнообразно. Поэтому столь же широк спектр их физиологической активности: сокращение гладкой мускулатуры кишечника, бронхов, зрачка глаза, медиация центральных (поведенческих) и гормональных процессов, высвобождение других физиологически активных веществ, периферическая ноцицепция.

Функциональное разнообразие тахикининов связано с их взаимодействием с другими физиологически активными веществами, как пептидной (бета-эндорфин, нейропептид Y, ген-кальцитониновый пептид), так и непептидной природы - допамином, интерлейкинами и др. Существенным в рассмотрении этой группы пептидов оказалось выявление сложной системы тахикининовых - нейрокининовых рецепторов (NK1, NK2, NK3) и их подтипов.

Современная фармакология тахикининов и вещества Р в значительной мере сосредоточена на исследовании тканевой и видовой специфичности этих рецепторов, а также поиске разнообразных антагонистов, нивелирующих эффекты тахикининов.[63,69].

Карбоксипептидаза N является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+.[54] Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0, активируется ионами Co2+ в 5-10 раз, ионами Ni2+ в 2-3 раза, ингибируется CuCl2, HgCl2, аминопропилмеркаптоянтарной кислотой, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином. Сульфат цинка, хлорид кальция, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПN [78]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и гуанидинопропилянтарная кислота с Ki 8,8 нМ и 7,5 нМ, соответственно. КПN ингибируется Met- и Leu-энкефалинами, веществом Р, вазопрессином, окситоцином, тиреотропин-рилизинг-фактором [59].

Уровни мРНК КПN и активности КПN в мозге и тканях в целом коррелируют между собой. Наивысшие уровни мРНК КПN обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КПN у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга.

В клетке КПN локализована, в основном, в секреторных гранулах, причем часто совместно с биологически активными пептидами - инсулином [45], энкефалинами [58], вазопрессином [71], окситоцином [70], веществом P [44], атриальным натрийуретическим фактором.[67].

Она обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми остатками основных аминокислот. КПN хорошо отщепляет остатки лизина и аргинина от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg [71], а также превращает 125I-Met-энкефалин-Arg6 и 125I-Met-энкефалин-Lys6 в 125I-Met-энкефалин. Фермент отщепляет остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГ1-14) и остатки аргинина с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu-энкефалин-Arg [58]. КПN с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [76].

Следует отметить, что уровень мРНК КПN способен быстро изменяться в ответ на внешние воздействия, вызывающие изменения уровня биологически активных пептидов или уровня их мРНК. Кроме того, в случае синтеза дефектной (неактивной КПN) (мутация в гене, кодирующем КПN) наблюдается нарушение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов.

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на организм и культуры клеток [13], нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПN свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, -эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий горомон, вещество Р и др. [6], а также участвует в (алкоголизм, стресс, болезнь Альцгеймера, в общем, в адаптационных процессах. [31]

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидил-карбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин, пептидилдипептидаза А, КФ 3.4.15.1) обладает пептидилдипептидазной и слабыми трипептидилкарбоксипептидазной и эндопептидазной активностями [50]. Он выделен и очищен из разных тканей, в том числе из мозга, различных видов животных[46]. Фермент из всех тканей (эндотелиальная форма), за исключением семенников (тестикулярная форма), имеет очень близкие физико-химические и иммунологические свойства, тогда как фермент из семенников отличается от ангиотензинпревращающего фермента из других источников по молекулярной массе и иммунологическим свойствам.

В мозге обнаружена только эндотелиальная форма. Она состоит из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу 170-180 кДа и содержит около 13% остатков нейтральных сахаров. Эндотелиальная форма состоит из двух гомологичных доменов, каждый из которых имеет активный центр и центр связывания Zn2+ [10].

Отличия в степени гликозилирования приводят к образованию двух иммунологически идентичных форм, одна из которых (эндотелиальная) с молекулярной массой 180 кДа присутствует, исключая семенники, во всех тканях, в том числе и мозге, а вторая (нейрональная) с молекулярной массой 170 кДа - обнаруживается только в мозге, и не присутствует в других тканях.[41]

Имеются единичные сообщения об обнаружении в различных органах и тканях более высокомолекулярных каталитически активных форм АПФ с молекулярной массой 600 кДа, 430 кДа, 330 кДа, 240 кДа, иммунологически полностью идентичных эндотелиальной форме. В настоящее время неясно, являются ли эти формы предшественниками АПФ, или образуются при гель-фильтрации благодаря склонности молекул фермента, как и других мембраносвязанных белков, к агрегации. pI фермента из различных органов и тканей колеблется в пределах от 4,6 до 5,1, что обусловливает дополнительную гетерогенность фермента при электрофоретическом разделении. Полагают, что гетерогенность АПФ может иметь важное значение для избирательности регуляции его активности в различных тканях. [25].

АПФ из различных источников имеет оптимум pH 7,6-8,2, для проявления максимальной активности необходимы ионы Cl- .[30] АПФ содержит 1 прочно связанный ион Zn2+ на каждый активный центр и сильно ингибируется хелатирующими агентами, такими как ЭДТА и о-фенантролином [61]. Фермент ингибируется брадикининпотенциирующим фактором (Ki 40 нМ), дитиотреитолом, 2-меркаптоэтанолом и додецилсульфатом натрия. N-этилмалеимид, бацитрацин, пуромицин, фосфорамидон, тиорфан, ингибитор металл-зависимых основных карбоксипептидаз ГЭМЯК не влияют на его активность [10]. Создан целый класс пептидных аналогов субстратов АПФ с Ki порядка 10-50 нМ, наиболее известные из них каптоприл (IC50 20 нМ), еналаприл (IC50 25-35 нМ), лизиноприл (IC50 3-10 нМ) [49].

Фермент in vitro катализирует расщепление в общей сложности более 30 биологически активных пептидов и их предшественников [75]. Он превращает ангиотензин I в ангиотензин II (Km 4-70 мкМ), последовательно отщепляет два дипептида с C-конца брадикинина, расщепляет неокиоторфин с образованием киоторфина (Km 0,58 мМ), Met-энкефалин-Arg6-Phe7 с образованием Met-энкефалина (Km 0,30 мМ), вещество P и вещество K, холецистокинин и гастрин, энкефалин, нейротензин, нейрокинины A и B, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона. АПФ катализирует образование Met-энкефалин-Arg6 из Met-энкефалин-Arg6-Gly7-Leu8, отщепляет последовательно два дипептида с C-конца динорфина A 1-8, расщепляет натрийуретический фактор из мозга и предсердий, вазопрессин, окситоцин.

Активность АПФ in vitro ингибируется многими биологически активными пептидами и их предшественниками: неокиоторфином, Met-энкефалин-Arg6-Phe7, -липотропином, веществом P, брадикинином, Leu-энкефалин-Arg6 и некоторыми дипептидами [10].

АПФ широко распространён в тканях человека и животных. Наиболее высокий уровень АПФ в периферических тканях обнаружен в лёгких и семенниках, в почках активность АПФ примерно в 25 раз меньше, чем в лёгких. В сыворотке крови активность АПФ примерно в 200 раз ниже, чем в лёгких [18]. Активность фермента в мозге сопоставима с активностью в почках. Наиболее высокое содержание АПФ обнаружено в гипофизе и стриатонигральном тракте. АПФ локализован преимущественно в синаптосомах [43]. В стриатонигральном тракте фермент связан с фракцией мембран, содержащей мускариновые рецепторы, причём в этой фракции обнаруживается только нейрональная, но не эндотелиальная форма АПФ. Таким образом, на мембранах дендритов локализована только нейрональная форма АПФ.[41]

Страницы: 1, 2