Состояние глутатионового звена антиоксидантной системы крови практически здоровых людей с лор-паталогиями, проживающих в различных районах города Красноярска

Состояние глутатионового звена антиоксидантной системы крови практически здоровых людей с лор-паталогиями, проживающих в различных районах города Красноярска

1

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ФОУ ВПО «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Кафедра биохимии и физиологии человека и животных

А.В.Тимохина

Студентка V курса

СОСТОЯНИЕ ГЛУТАТИОНОВОГО ЗВЕНА АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ КРОВИ ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И ЛЮДЕЙ С ЛОР-ПАТОЛОГИЯМИ, ПРОЖИВАЮЩИХ В РАЗЛИЧНЫХ РАЙОНАХ ГОРОДА КРАСНОЯРСКА

(дипломная работа)

Красноярск 2008

СОДЕРЖАНИЕ

• Список сокращений 3
• Введение 4
• Глава 1. Обзор литературы 6
• 1.1. Уровень антропогенной нагрузки на здоровье населения в условиях промышленного города 6
• 1.2. Активные формы кислорода: свойства и механизмы образования 9
• 1.3. Характеристика антиоксидантной системы 15
• Глава 2. Материалы и методы 24
• 2.1. Объект исследования 24
• 2.2. Приготовление эритроцитов 25
• 2.3. Определение содержание гемоглобина 25

2.4. Определение количества восстановленного глутатиона…………………26

• 2.5. Определение активности глутатионпероксидазы 28
• 2.6. Определение активности глутатион-S-трансферазы 29
• 2.7. Определение активности глутатионпероксидазы 30
• 2.8. Статистическая обработка результатов 32
• Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 33
• 3.1. Анализ содержания GSH и активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями 33
• 3.2. Анализ содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей, проживающих в различных по уровню загрязнения районах г.Красноярска 37
• 3.3. Анализ содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови здоровых мужчин и женщин 40
• 3.4. Содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей различного возраста 41
• Выводы 44
• Список литературы 45
• Summary 52
• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
• АФК - активные формы кислорода
• АОС - антиоксидантная система
• ДНК - дезоксинуклеиновая кислота
• КрАЗ - Красноярский Алюминиевый Завод
• ПОЛ - перекисное окисление липидов
• ПДК - предельно допустимая концентрация
• РНК - рибонуклеиновая кислота
• ТЭЦ - топливо-энергитический центр
• цАМФ - цикло-аденозинмонофосфат
• GSH - восстановленный глутатион
• GPO - глутатионпероксидаза
• GR - глутатионредуктаза
• GST - глутатион-S-трансфераза
• NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
• NADFH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
• СРО - свободнорадикальное окисление
• NRF - ядерный респираторный фактор
• ВЕДЕНИЕ
• В последние десятилетия в связи с огромным развитием промышленности экология индустриальных городов значительно ухудшилась, это результат больших техногенных выбросов предприятий стоящих на территории городов или вблизи них [Иванова с соавт., 2001].
• По степени загрязнения атмосферы город Красноярск входит в число наиболее загрязненных городов Российской Федерации. На территории города располагаются крупные предприятия, которые являются основными поставщиками загрязняющих веществ в атмосферу города, к таким предприятиям относятся две ТЭЦ, алюминиевый, цементный, целлюлозно-бумажный, фармацевтический заводы [Симонова, 2002]. Только ОАО «Красноярский Алюминиевый завод» имеет объемы выбросов в атмосферу в размере 58,6 тыс. в год. Основными компонентами химического загрязнения окружающей среды от КрАЗа являются: фтористый водород, плохорастворимые неорганические фториды, оксиды алюминия, оксид углерода бенз(а)пирен, сернистый ангидрид [Игамбердиев, 2004]. Превышение ПДК наблюдается по фторидам газообразным - до 2,79 раз; по бенз(а)пирену - до 4,42 раз; по плохо растворимым фторидам - до 3,16 раз. При этом уровень загрязнения атмосферы жилой зоны города по фторидам газообразным составил 1,19-1,57 ПДК на 2003 год [Реброва, 2003]
• По данным ряда авторов фтор и его производные в умеренных дозах является необходимым элементом живых организмов, наибольшее его содержание отмечено в зубах и костях, низкие концентрации - повышают устойчивость зубов к кариесу, стимулируют кроветворение, репаративные процессы при переломах костей и реакции иммунитета, участвуют в росте скелета, избыточное поступление фтора в организм вызывает флюороз. При ингаляционном поступлении в организм газообразных соединений фтора и содержащих фтор аэрозолей возникают атрофические изменения слизистой оболочки верхних дыхательных путей и бронхов, возможно развитие ринита, фарингита, ларингита [Богданов, Гембицкий, 1975].
• Дыхательная система является входными воротами для попадания в организм поллютантов техногенного происхождения. Действия пылевых частиц на респираторные органы вызывает образование большого числа активных форм кислорода (АФК), и приводят к развитию окислительного стресса. Антиоксидантная система осуществляет защиту организма от пагубного действия прооксидантов и ограничивает развитие окислительного стресса [Ковальчук, 2004].
• ЦЕЛЬ: оценить состояние глутатионового звена антиоксидантной системы в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями, проживающих в различных по уровню загрязнённости районах города Красноярска.
• ЗАДАЧИ РАБОТЫ:
• 1. Изучить содержание GSH и активность GPO, GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с хроническим ЛОР-заболеваниями.
• 2. Определить содержание GSH и активность GPO, GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых людей проживающих в различных по уровню загрязнения районах г. Красноярска.
• 3. Провести сравнительный анализ содержания GSH и активности GPO, GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых мужчин и женщин.

4. Выяснить содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей различного возраста, проживающих в районах с разной техногенной нагрузкой г. Красноярска.

Работа выполнена на базе кафедры биохимии и физиологии человека и животных Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Уровень антропогенной нагрузки на здоровье населения в условиях промышленного города

Анализ исследований за последнее десятилетие показал, что атмосферный воздух загрязняется вследствие образования загрязняющих веществ в концентрациях, превышающих нормативы качества или уровня естественного содержания. Мощность антропогенного воздействия на атмосферу увеличивается с каждым годом. За последние 25 лет ее техногенная запыленность возросла на 70%. Ежегодно, в результате деятельности человека, в атмосферу выбрасываются миллионы тонн загрязняющих веществ: диоксиды серы, оксидов азота, углерода, хлорфторуглероды (фреоны), которые отрицательно действуют на физико-химические свойства атмосферы и на здоровье людей [Пинигин, 1991; Новиков,1999].

Наиболее активными поставщиками поллютантов - веществ, загрязняющих атмосферу, являются автомобили, коксохимические, цементные, нефтеперерабатывающие, сталеплавительные, целлюлозобумажные, металлургические заводы, ТЭЦ, то есть отрасли, без процветания которых современный человек не мыслит своего существования [Онищенко, 2003].

Практически каждый поллютант является высокотоксичным веществом, постепенно разрушающим здоровье человека. Так, например, при сгорании угля и мазута выделяется двуокись серы, она вызывает легочные и аллергические заболевания, окись углерода, образующаяся при сгорании всех видов топлива, поражает сердечно-сосудистую систему, углеводороды, содержащиеся в выхлопных газах автомобилей, канцерогены, пылевидные отходы (цементный завод выбрасывает около 15 тонн пыли в сутки) провоцирует развитие бронхиальной астмы, заболеваний легких [Савин, 2001].

Как известно, человек подвержен экологическому влиянию не только в широком смысле понимания этого термина как окружающей человека среды, но и непосредственно во время его производственно - профессиональной деятельности. Трудовая деятельность человека не только ухудшает качество среды, но и обеспечивает условия труда, которые, являясь существенным фактором части окружающей среды (производственной среды), зачастую оказывают негативное влияние на работающего человека [Haglof, 2003]. Абсолютные величины предельно допустимых концентраций (ПДК) одних и тех же веществ в воздухе рабочей зоны от нескольких десятков до нескольких тысяч раз выше среднесуточных ПДК для атмосферы [Кучма, 2002]. Поэтому суммарная нагрузка вредными веществами на рабочего во столько же выше по сравнению с нагрузкой на население в целом. Наиболее распространенным профессиональным заболеванием рабочих алюминиевого производства является хроническая фтористая интоксикация - профессиональный флюороз, который составляет 70 % всех профессиональных заболеваний в данной области [Коцнельсон с соавт., 2000]. Обязательным проявлением профессионального флюороза является не только остеосклероз, но и дегенеративно-дистрофические изменения опорно-двигательного аппарата по существу возрастного характера, что развиваются они намного раньше и носят не только двухсторонний, но и симметричный характер. Явно опережающей хронологические сроки наступление кардинального признака старения (вероятности смерти по мере взросления) является и демографическая ситуация. Так продолжительность жизни рабочих алюминиевого завода составляет около 44 лет. Сроки развития профессионально флюороза зависят в большей степени от возраста начала работы в контакте с фтористыми соединениями и мышечных нагрузок [Гичев, 2002].

Изучение закономерностей формирования здоровья населения, проживающего в зоне влияния выбросов алюминиевых производств, остается актуальной гигиенической задачей. Как известно, основными вредными факторами алюминиевого производства является фтор, его соли и фтористый водород. По данным ряда авторов уровень загрязнения атмосферного воздуха фтористыми соединениями в зоне влияния выбросов алюминиевого завода превышает ПДК в 1,6-2,1 раза. Фтористые соединения так же обнаруживаются в воде и почве и превышают контрольные в 5 раз [Иванова с соавт., 2001]. Токсичные соединения фтора в значительном количестве поступают через дыхательные пути, с продуктами питания, питьевой водой. Имеется ряд исследований о влиянии фтористых соединений на состояние перекисного окисления липидов мембран клеток и антиоксидантной защиты [Cavalca, et al., 2001]. Длительное воздействие на организм токсичных соединений фтора, фтористоводородной кислоты приводит к формированию выраженных функционально-структурных нарушений, к угнетению биоэнергетического обмена в эритроцитах, белково-образовательной функции печени, усилению пролиферативно-клеточной реакции. Высокая реакционность фтора делает возможным его проникновение через защитные барьеры организма, нарушая целостность мембран, усиливая процессы липопероксидации. Результаты ряда исследований свидетельствую о том, что фтор и его соединения вызывают системное поражение организма, которое проявляется рядом специфических заболеваний [Кацнельсон с соавт., 2000].

В литературе приводятся данные, что для интоксикации фтором характерно разнообразное воздействие на обменные процессы. Этот элемент обладает высоким сродством к некоторым элементам, например, кальцию и магнию, с которыми он комплексуется в клетке [Мамырев, Богатова, 2002]. Фтор способен выступать в качестве регулятора ферментативной активности в клетке. Он обладает ингибирующим действием на металлопротеины. Это, по-видимому, обусловлено тем, что он представляет собой один из наиболее “жестких” лигандов, то есть, способен образовывать прочные комплексы с ионами “жестких” металлов, к которым относятся почти все металлы в биологических системах [Генкин, Глотов, Ждахина, 1983]. В силу этого обстоятельства при увеличении концентрации фтор способен “вклиниваться” в структуру биокоординационных соединений и замешать некоторые ионы-лиганды (например, гидроксил-ионы), в результате чего изменяется конформация соединения, что и приводит к “ухудшению” взаимодействия фермента с субстратом, то есть к ингибированию ферментативной активности [Ройт,1991]. Наибольшей прочностью отличается соединение фтора с ионами магния, в силу чего большинство Мg2+-зависимых ферментных систем по своей чувствительности к ингибирующему воздействию фтора в несколько раз превосходят ферменты, активируемые другими ионами, например Мn2+.Существуют данные о влиянии фтора на активность некоторых энзимов, например липаз, через их лабильный компонент - кофермент [Разумов, 1997]. Из литературных источников известно, что фтор способен оказывать ингибирующее влияние на ферменты цикла трикарбоновых кислот и цепи переноса электронов: НАДН- зависимые дегидрогеназы, цитохромоксидазу, сукцинатдегидрогеназу, -кетоглутаратдеги-дрогеназу. Наибольшей чувствительностью из них к фтору обладает сукцинатдегидрогеназа [Abiaka, 2000].

1.2. Активные формы кислорода: свойства и механизмы образования

Обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни является генерация АФК - прооксидантов. Функционирование и развитие клеток не могло быть возможным без существования защитных систем, к которым относиться специализированные ферментативные и неферментативные актиоксиданты [Меньщикова c соавт, 2006]. Постоянное образование прооксидантов уравновешенно их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходимо непрерывная генерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбой этой непрерывности приводят к развитию окислительного стресса, к возникновению и накоплении окислительных повреждений, что сопровождает ряд физиологических процессов - таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхо-легочное заболевание, старение и др.

В живых организмах существует два разных источника АФК: радикальные окислительные реакции и металопротеиновые ферментативные системы. В обоих случаях молекулярный кислород выступает акцептором электронов. Наличие у молекулярного кислорода двух неспаренных электронов существенно ограничивает его реакционную способность. В процессе эволюции у живых организмов выработались специальные ферментативные системы, которые восстанавливают молекулярный кислород, перенося на него один, два или четыре электрона. Главные ферменты, которые осуществляют метаболизм кислорода в организме млекопитающих - оксидазы и оксигеназы. В активных центрах этих ферментов кислород превращается в этих продуктах и не выходит в окружающую среду, но при этом они не подвергают опасности органические молекулы, а опасными являются активные формы кислорода, которые образуются как побочные вещества в ходе этих превращений [Меньщикова c соавт, 2006].

Главные АФК: супероксидный радикал , перекись водорода , гидроксильный радикал , синглетный кислород , гипогалоиды алкоксильный радикал и перекисный радикал .

Характеристика основных форм АФК

Супероксидный радикал. Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксидного анион радикала (), который при взаимодействии с протоном переходит в гидроперекисный радикал () [Бурлакова с соавт., 1992]. В живых системах супероксидный анион является промежуточным продуктом многих биохимических реакций - окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, ксонобиотиков. Но основные источники его образование - ферментативные системы: NADFH-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы. При активации фагоцитов в очаге воспаления генерация служит пусковым звеном целого каскада реакций, приводящих к образованию других форм АФК. Для регуляции уровня в клетках служит высокоспецифичный фермент - антиоксидант супероксиддисмутаза, которая существенно ускоряет реакции дисмутации до перекиси водорода [Зенков, Меньщикова, 2004].

Перекись водорода. Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону сопровождается образованием двухзарядного аниона , который в свободном состоянии не существует, присоединяя протоны он переходит в гидроперекисный анион [Brune, Messmer, 1995]. Перекись водорода - слабый окислитель, в отсутствии каталазы и ионов металлов переменной валетности она относительно стабильна и может мигрировать в клетке и ткани. В живых организмах источниками служат ферментативные реакции с оксидазами, реакция дисмутации, катализируемая SOD [Зенков, Меньщикова, 2004].

Клетки млекопитащих достаточно устойчивы к воздействию , благодаря наличию глутатионпероксидазной и каталазной ферментативных систем, первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая - при высоких.

Гипогалоиды. Образуются главным образом в результате ферментативной реакции перекиси водорода с галидами, катализируемой миелопероксидазой, пероксидазой эозинофилов, которые различаются по структуре и субстратной специфичности. Основным продуктом миелопероксидазы является , пероксидаза эозинофилов катализирует образование и. Гипогалоиды инактивируют -антитрипсин, переводят коллагеназу в активную форму Б, окисляют лейкотриены, иммуноглобулины, альбумин, церулоплазмин, трансферрин. Вызывают структурную модификацию и инактивацию ,-SOD могут как индуцировать, так и ингибировать процессы ПОЛ.

Гидроксильный радикал является наиболее реакционноспособным АФК, образующимся в биологических системах, он может разрывать любую углеродную связь [Андреев, 1999]. Образование ОН-радикала показано в реакциях окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габера-Вейса, при микросамальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и убихиноном, но основным источником OH-радикалов в биологических системах служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом :

Обратное восстановление возможно в реакции с :

а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими окисляющимися соединениями [Зенков, Меньщикова, 2004].

Синглетный кислород. В кислороде внутримолекулярно происходит перестройка электронов и возникает более высокий энергетический уровень [Владимиров, 1998]. Источником синглетного кислорода являются реакции фотосенсибилизированного окисления биологических субстратов, при не фотохимических реакциях не ферментативная дисмутация супероксидных радикалов, протекающие с образованием перекиси водорода. обладает высокой химической активностью, особенно по отношению к молекулам, содержащим участки повышенной электронной плотности.

Алкоксильные и перекисные радикалы. При развитии радикальных окислительных процессов взаимодействие органических радикалов молекулярным кислородом приводят к образованию перекисных радикалов, которые с алкоксильными радикалами могут образовываться в реакциях разложения перекиси в присутствии ионов металлов переменной валентности. По физико-химическим свойствам алкоксильные и перекисные радикалы это очень гетерогенный класс соединений, включающий высокореакционный OH-радикал и мало активные радикалы фенольных антиоксидантов. Взаимодействие и с углеводородами, приводящие к образованию и - это наиболее медленная стадия развития радикальных окислительных процессов [Владимиров, 1998].

Биологический эффект и реализуется через повреждающее действие на белки, ферменты, нуклеиновые кислоты, через продукты ПОЛ - органические перекиси, альдегиды, кетоны, эпоксиды, которые высокотоксичны для клеток. Ингибиторы - аскорбиновая кислота, мочевая кислота, убихинон, селен, -токоферол [Андреев, 1999].

Все формы АФК обладают высокой цитотоксичностью для клеток и клеточных образований. Можно выделить четыре мишени окислительной цитотоксической атаки АФК: индукция процессов ПОЛ в биологических мембранах, повреждение мембрансвязанных белков, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток.

Аминокислоты, из которых состоят белки, подвержены окислительному действию АФК, что приводит к трем вариантам изменения физико-химических свойств белков: фрагментации, агрегации и повышению чувствительности к протеолизу. В первую очередь воздействию кислородных радикалов подвергаются остатки пролина гистидина и аргинина. Окислительное повреждение приводит к денатурации и агрегации белков (хрусталика глаза). Агрегация белков связана со способностью АФК образовывать межмолекулярные сшивки. В результате денатурации белков нарушается их конформация, и они становятся более уязвимыми к действию протеолитических ферментов [Зенков, Меньщикова, 2004].

Окислению АФК в первую очередь подвергаются SН-содержащие группы белков; их окисление приводит к снижению содержания восстановленных и повышению уровня окисленных SН-групп, поэтому соотношение окисленных и восстановленных SН-групп белков может быть использовано в качестве показателя развития окислительного стресса. Наиболее подвержена окислительному стрессу Са2+-АТФаза, ее повреждение приводит к нарушению транспорта кальция через мембрану [Владимиров, 1999].

Карбонильные группы и гидроперекиси, образующиеся при окислении белков, также является показателем свободнорадикального окисления.

Окисление липидных молекул приводит к необратимому изменению мембранных структур, нарушению их проницаемостью для ионов. Наиболее подвержены перекисному окислению входящие в состав мембран ненасыщенные жирные кислоты: линолевая, арахидоновая, докозагексаеновая [Козлов, 2006]. Одним из важнейших следствий избыточного образования АФК является избыточная и неконтролируемая в этих условиях активация процессов ПОЛ. Процессы ПОЛ можно условно подразделить на три последовательных этапа, или фазы развития: процессы зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей. На стадии зарождения цепей под действием свободных радикалов кислорода, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит образование органических радикалов (R).

На следующей стадии радикал быстро взаимодействует с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате происходит образование пероксирадикала (RО2), который атакует ненасыщенные липиды. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала (R) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер:

R + О2 RО2

Органические перекиси (RООН) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала:

Часть образующихся органических радикалов взаимодействует друг с другом, при этом происходит образование неактивных молекул, что обрывает ход реакций свободнорадикального окисления. Гидроперекиси липидов способны подвергаться нерадикальным окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коньюгаты, диальдегиды), промежуточных (основания Шиффа) и конечных продуктов ПОЛ, а также спиртов, кетонов и альдегидов. Обрыв цепных реакций перекисного окисления возможен при взаимодействии радикалов со специализированными ферментными системами, а также с рядом низкомолекулярных веществ, совокупно формирующих биохимический компонент антиоксидантной системы организма [Меньщикова с соавт., 2006].

Одним из конечных продуктов ПОЛ является насыщенные низкомолекулярные углеводороды (этан, гексан, пентан), которые в нормальных условиях переходят в газообразное состояние.

Страницы: 1, 2, 3