Регуляция транскрипции у прокариот и эукариот

Регуляция транскрипции у прокариот и эукариот

ЛЕКЦИЯ

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ У ПРО- И ЭУКАРИОТ

Экспрессия генов как у прокариот, так и у эукарит регулируется при помощи целого ряда механизмов. Некоторые из механизмов такого рода, действующие в бактериальных системах, изучены довольно хорошо, но о том, как действуют регуляторные механизмы в клетках эукариот известно немного.

Осуществляя контроль за тем, каким генам экспрессироваться, а каким нет, а также регулируя уровень экспрессии различных генов, клетки приспосабливают свой фенотип к определенным условиям внешней и внутренней среды. Часто гены экспрессируются последовательно: активация одного гена вызывает экспрессию другого или нескольких генов, приводя, в конечном счете, к каскаду событий. Некоторые гены или родственные группы генов экспрессируются координировано, т.е. отвечают на регуляторный сигнал одновременно и, как правило, в одинаковой степени. Вероятно, наиболее совершенные регуляторные системы - те, которые позволяют плюрипотентным стволовым клеткам (митотически активные клетки, в результате деления которых происходит замещение погибших клеток в многоклеточном организме) дифференцироваться с образованием клеток разного типа в процессе развития сложного организма.

Фенотипические признаки клеток разных типов, а также одной и той же клетки в различных условиях зависят от количества и свойств продуцируемых ими структурных, каталитических и регуляторных белков. Регулироваться может какой-то один или несколько отдельных этапов считывания генетической информации при синтезе белка.

Согласованная регуляция экспрессии прокариотических генов

Согласованная регуляция групп родственных генов. У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции, часто регулируются согласованно. Это значит, что их экспрессия начинается и заканчивается или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскрибируются с промотора, находящегося на 5'-конце такой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным (или полигенным) транскриптом. Группа координированно экспрессирующихся генов называется опероном.

Гены, кодирующие несколько родственных функций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены, кодирующие 30S- и 50S-рибосомные белки, организованы во множественные оперoны, в чей состав иногда входят гены, кодирующие другие белки, которые участвуют в транскрипции и/или трансляции. Как правило, отдельные опероны, кодирующие родственные функции, имеют одинаковые или сходные регуляторные последовательности и поэтому реагируют на определенный регуляторный сигнал сходным образом.

Позитивная и негативная регуляция

- Негативная регуляция инициации транскрипции, или репрессия, осуществляется белками-репрессорами, которые связываются с операторами. Поскольку последовательности оператора и промотора часто перекрываются, связывание репрессоров со своими операторами ограничивает доступ РНК-полимеразы к промотору, подавляя тем самым инициацию транскрипции.

Позитивная регуляция может осуществляться путем связывания специфических белков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, следовательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.

в) Регуляция экспрессии лактозното оперона

Рассмотрим позитивную и негативную регуляцию лактозного оперона

- Негативная регуляция лактозного оперона. Бактерии Е. coli могут использовать в качестве единственного источника углерода и энергии лактозу, поскольку они способны образовывать в большом количестве ?-галактозидазу- фермент, расщепляющий лактозу на глюкозу и галактозу. Однако при росте на других источниках углерода в клетках E.coli образуется очень мало ? -галактозидазы. Ген, ответственный за синтез ? -галактозидазы (lac Z), называется индуцибельным, поскольку кодируемый им фермент синтезируется только тогда, когда в клетке присутствуют сахара, имеющие ? -галактозильные остатки. Помимо ? -галактозидазы, ? -галактозиды индуцируют образование еще двух белков: (? -галактозидпермеазы (кодируемой геном lacY), необходимой для проникновения ?-галактозидов в клетку, и ? -галактозидтрансацетилазы (lac А), фермента с невыясненной пока функцией (прозрачка 5). В этих трех генах- lac Z, lacY и lac А- содержится вся информация о белках, кодируемых lac-опероном. Они транскрибируются в единую полицистронную РНК, при трансляции которой образуются почти одинаковые количества соответствующих белков. Поэтому можно сказать, что три гена lас-оперона экспрессируются согласованно.

Со структурными генами lac-оперона связаны несколько типов регуляторных элементов, ответственных за индуцибельность и координированную регуляцию этих генов (прозрачка 5). Промотор - это нуклеотидная последовательность, с которой связывается РНК-полимераза и начинается транскрипция трех структурных генов. Оператор - это сайт, с которым связывается lac-репрессор, подавляющий транскрипцию lас-оперона. Ген 1асI, не входящий в состав lас-оперона, кодирует репрессор - полипептидную цепь с мол. массой 37 000 Да. Репрессор прочно связывается с оператором, находясь в тетрамерной форме.

Поскольку промоторная и операторная последовательности перекрываются, связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНК-полимеразы с промотором, что приводит к блокированию транскрипции структурных генов. Транскрипцию оперона можно индуцировать, если блокировать связывание репрессора с оператором (прозрачка 6). Такое блокирование происходит при связывании одного из ? -галактозидов с той или иной субъединицей репрессора, что уменьшает сродство последнего к оператору. После отсоединения репрессора от промотра полимераза может связаться с промотором и инициировать транскрипцию оперона.

Очень важно сохранение нуклеотидной последовательности домена lас-оператора, связывающего репрессор. Об этом свидетельствуют результаты исследования эффективности репрессии in vivo у мутантов с модифицированными репрессорами или операторами (прозрачка 7). Интересные данные были получены и при изучении связывания очищенных репрессорных белков с операторами дикого типа и мутантными формами in vivo. Мутации, уменьшающие сродство репрессора к оператору, приводили к конститутивному синтезу ферментов, кодируемых lac-опероном, т. е. к экспрессии lас-ферментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопровождающиеся накоплением репрессора в клетках или увеличением сродства репрессора к оператору, делали lас-оперон неиндуцибельным.

Позитивная регуляция лактозного оперона. Для экспрессии lас-оперона, как и других индуцибельных оперонов, которые осуществляют контроль синтеза ферментов, участвующих в метаболизме cахаров, необходимо не только снять репрессию оперона, но и получить некий сигнал; Таким сигналом служит комплекс циклического АМР (сАМР) с белком-активатором катаболизма (CAP, от англ. catabolite activator protein), который связывается со специфической последовательностью, находящейся в самом начале lac-промотора (прозрачка 8).

сАМР, принимающий участие во многих клеточных процессах, образуется из АТР (прозрачка 8а) в ответ на самые разные вне - и внутриклеточные события.

САР представляет собой димер из идентичных полипептидных цепей с мол. массой 22 кДа.

Связывание комплекса САР-сАМР со специфической последовательностью в начале промотора приводит к усилению транскрипции lac-оперона почти в 50 раз. Сам по себе CAP не способен к такому связыванию и стимуляции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью комплекса САР-сАМР можно объяснить:

связываясь с ДНК в непосредственной близости от сайта присоединения РНК-полимеразы, он усиливает сродство этого фермента к промотору (прозрачка 9).

Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание САР-сАМР с САР-сайтом предотвращает присоединение РНК-полимеразы к расположенному поблизости слабому промотору и увеличивает тем самым вероятность того, что полимераза свяжется с «правильным» промоторным сайтом. Высказывавшееся ранее предположение, что комплекс САР-сАМР изменяет топологию ДНК, так что облегчаются связывание полимеразы и транскрипция, кажется несостоятельным.

Комплекс САР-сАМР является положительным сигналом при регуляции экспрессии и других оперонов, в частности тех, которые кодируют ферменты расщепления углеводов (галактозный и арабинозный оперон) а также работу оперонов, кодирующих ферменты, которые участвуют в деградации аминокислот, пуринов и пиримидинов.

г). Регуляция экспрессии триптофанового оперона

Триптофановый оперон состоит из оператора, и пяти структурных генов (А-Е). Последний кодирует ферменты, участвующие в биосинтезе триптофана - одной из незаменимых ам.к. по мере увеличения концентрации триптофана наступает момент, когда его дальнейший синтез становится нежелательным и транскрипция прекращается.

Триптофан синтезируется в Е.соli из ароматического предшественника - хоризмовой кислоты - в ходе пяти последовательных реакций, катализируемых ферментным комплексом из пяти белков (прозрачка 10, 2). Эти кодируемые trp-опероном белки образуются согласованно, примерно в равных количествах, при трансляции полицистронной мРНК длиной 7000 нуклеотидов, транскрибируемой с промотора. При наличии в среде достаточного для роста бактерий количества триптофана клетки Е. coli образуют ферменты биосинтеза триптофана в очень малых количествах. Однако если клетки лишены экзогенного триптофана, то в них начинается довольно интенсивный синтез всех пяти ферментов. Содержание ферментов этой группы в клетках Е.соli может различаться до 700 раз в зависимости от внутриклеточного уровня триптофана.

Подобный разброс в уровне экспрессии обусловлен наличием двух практически независимых механизмов регуляции, каждый из которых «подгоняет» уровень синтеза trp -мРНК к концентрации внутриклеточного триптофана.

Механизмы: их два. Эффекты этих двух регуляторных механизмов комплементарны, мультипликативны и позволяют увеличивать степень экспрессии оперона.

основан на репрессии, изменяющей эффективность инициации транскрипции в промоторе.

Репрессия триптофанового оперона.

Транскрипция trp -оперона блокируется, когда репрессор связывается с последовательностью trp -оператора. Ген trp R, кодирующий репрессорный белок мол. массой 58 000 Да, находится далеко от trp -оперона. Для того чтобы trp R-белок мог связаться с оператором и действовать как репрессор, он должен образовать комплекс с триптофаном. Поскольку уровень экспрессии trpR очень низок и не зависит от триптофана, концентрация активного репрессора отражает концентрацию внутриклеточного триптофана.

Нуклеотидные последовательности trp -оператора и промотора перекрываются (прозрачка 11, 2), поэтому связывание комплекса репрессор-триптофан с оператором препятствует правильному взаимодействию РНК-полимеразы с промотором. При этих условиях транскрипция оперона не осуществляется и ферменты биосинтеза не образуются. В отсутствие триптофана не происходит и связывания репрессора с оператором, что позволяет РНК-полимеразе без помех инициировать транскрипцию на промоторе и. синтезировать мРНК.

называется аттенуацией и регулирует транскрипцию с помощью сигнала терминации транскрипции, расположенного между промотором и началом первого структурного гена (прозрачка 10, 3).

Аттенуация экспрессии триптофанового оперона.

Регуляция работы триптофанового оперона с помощью аттенуации осуществляется при участии последовательности, находящейся на расстоянии примерно 100-140 пар оснований от начала транскрипции (прозрачка 10). Этот так называемый лидерный сегмент, trpL, содержит аттенуаторную последовательность, которая вынуждает РНК-полимеразу прервать транскрипцию как раз перед началом trp Е-гена с отделением фрагмента РНК длиной 141 нуклеотид- trp-лидерной мРНК. Подобная терминация происходит при уровнях триптофана в клетках от среднего до высокого. При низком уровне триптофана терминация транскрипции в пределах аттенуаторной последовательности в значительной мере блокируется, и транскрипция проходит через терминатор с образованием полноразмерной мРНК trp-оперона.

Механизм регуляции терминации транскрипции в аттенуаторе с помощью изменения содержания триптофана.

Ответ на этот вопрос был получен после того, как определили нуклеотидную последовательность аттенуатора и установили, что на аттенуацию влияет трансляция, идущая одновременно с транскрипцией. Участок из первых 145 нуклеотидов транскрипта trp-оперона содержит три необычных по нуклеотидной последовательности сегмента (прозрачка 12). Один из них кодирует короткий полипептид из 14 аминокислот, две из которых являются тандемными триптофановыми остатками. Два других содержат инвертированные повторы, из-за чего происходит внутримолекулярное спаривание оснований РНК-транскрипта и образование двух альтернативных шпилечных структур (прозрачка 13). Одна из этих структур, в которой спарены сегменты 1 и 2, 3 и 4 соответственно, опосредствует ?-независимую терминацию транскрипции на участке из нескольких расположенных подряд за четвертым сегментом остатков урацила (разд. 3.2.г). Другая шпилечная структура, в которой сегменты 2 и 3 спарены, а 1 и 4 остаются одноцепочечными, разрешает транскрипции дойти до конца оперона.

Какая именно шпилечная структура образуется при транскрипции аттенуаторного участка - зависит от того, транслируется ли рибосомами полная последовательность, кодирующая полипептид длиной 14 аминокислот. Если синтез лидерного полипептида инициируется в кодоне AUG (прозрачка 12), то рибосомы транслируют следующие 13 кодонов при условии, что имеются все необходимые аминоацил-тРНК. При недостатке триптофанил-тРНК рибосомы останавливаются, когда доходят до тандемных триптофановых кодонов. Если рибосомы останавливаются в одном из триптофановых кодонов, расположенных в аттенуаторном сегменте 1, то последовательности сегментов 2 и 3 свободно спариваются и образуют шпилечную структуру, а сегмент 4 остается одноцепочечным (прозрачка 14). Эта структура не препятствует продолжению транскрипции с образованием полноразмерной trp-мРНК. длиной 7000 нуклеотидов. Если триптофанил-тРНК имеется в количестве, достаточном для трансляции тандемных триптофановых кодонов, то рибосомы движутся до терминаторного кодона лидерного пептида и, поскольку сегмент 2 ассоциирован с рибо-сомой, сегменты 3 и 4 образуют шпильку - структуру, способствующую терминации транскрипции.

Таким образом, аттенуатор позволяет РНК-полимеразе опосредованно «почувствовать» концентрацию триптофанил-тРНК через расположение рибосомы. Возможность трансляции короткой кодирующей последовательности в лидерном сегменте определяет вторичную структуру транскрипта и, следовательно, выбор между терминацией и прочтением последовательности. Наличие достаточного количества триптофанил-тРНК стимулирует терминацию транскрипции, при ее недостатке транскрипция проходит весь оперон.

Суммарный эффект аттенуации и репрессии

Аттенуация и репрессия вместе содействуют оптимальной экспрессии trp-оперона. При избытке триптофана благодаря репрессии блокируется инициация синтеза мРНК. Снижение концентрации триптофана приводит к уменьшению содержания функционального комплекса репрессор - триптофан, и транскрипция возобновляется. Однако при концентрации триптофана, допускающей инициацию транскрипции, количества триптофанил-тРНК еще вполне достаточно для того, чтобы в пределах лидерного участка в основном происходила терминация транскрипции; следовательно, в таких условиях уровень экспрессии оперона еще очень низок. По мере снижения концентрации триптофана репрессия полностью снимается: если концентрация триптофанил-тРНК становится ниже уровня, необходимого для продолжения синтеза, то терминация аттенуируется, а trp-мРНК и ферменты начинают синтезироваться с большей скоростью. Таким образом, экспрессия оперона достигает максимума в отсутствие репрессии и при максимальной аттенуации терминации; экспрессия минимальна при почти полной репрессии оперона и отсутствии аттенуации терминации.

Аттенуация как общий механизм

Аттенуация используется при регуляции экспрессии многих генов и оперонов как у Е.соli, так и у других организмов. Оперон, кодирующий девять ферментов, которые участвуют в биосинтезе гистидина, регулируется исключительно с помощью аттенуации; аттенуатором служит полипептид-кодирующая последовательность с шестью тандемными гистидиновыми кодонами. У оперонов, функционирование которых зависит от содержания определенных аминокислот - треонина и изолейцина (или лейцина), валина и изолейцина, - лидерный участок буквально «напичкан» кодонами для этих аминокислот. Антитерминация, т.е. ослабленная терминация, не требует сопряжения трансляции и транскрипции. Она может осуществляться некоторыми белками, допускающими экспрессию особых кластеров генов только после того, как синтезированы белки, способствующие аттенуации.