Психрофільні мікроорганізми та їх використання

Графік 1. Крива Арреніуса для швидкості росту психрофілів

Графік дає уявлення, що швидкість росту для облігатного психрофілу залишається лінійною до -2 °С, а для факультативного відхилення починається за декілька градусів від нуля. Це вкрай важливе спостереження, оскільки воно може являтися фактором, що приводить до екологічного домінування в місце існуваннях з низькою температурою. Ці данні були підтвердженні в експериментах з морськими психрофілами в модельних системах, а також в умовах безперервного культивування. В цих дослідах облігатні психрофіли виявилися більш конкурентно спроможними, при температурах нижче 15 °С.

Іншим показником є температурний коефіцієнт росту (Q10) він визначається як відношення швидкостей при одній температурі та при іншій на 10 °С нижчій.

Q10=Kt-/Kt

Формула 2. Температурний коефіцієнт росту

Для функції росту коефіцієнт може бути визначений в будь-якому інтервалі температур ?Т з допомогою наступної формули:

Формула 3. Температурний коефіцієнт Q10 для функції росту при температурі ?Т

К1 та К2 -температурні коефіцієнту росту з різницею в 10 °С

Залежність швидкості біологічних реакцій від температури робить цей показник досить зручним чинником для порівняння мікроорганізмів по ступеню стійкості швидкості росту до зниження температури[12].

2.2 Фактори, що обумовлюють низьку максимальну температуру росту

Вважається, що верхня температурна межа росту мікроорганізмів залежить від термолабільних одного або кількох важливих у хімічному або структурному відношенні компонентів. Очевидно, якщо клітинний компонент (або будь-яка активність) відрізняється чутливістю до температури, близької до максимальної температури зростання, то між цією чутливістю і верхньою межею зростання повинен існувати причинний взаємозв'язок. Крім того, іноді вдається простежити позитивний взаємозв'язок між зменшенням термолабільності одного або декількох клітинних компонентів (або активності) і збільшенням максимальної температури зростання мікроорганізмів. Деякі дослідники культивували мікроорганізми при температурах як вище, так і нижче дійсної максимальної температури їх зростання. Дані, отримані в результаті таких експериментів, сприяють кращому розумінню механізмів, які визначають верхню межу зростання психрофільних і психротрофних мікроорганізмів. Синтез білків інтактними клітинами деяких психрофільних мікроорганізмів при відносно помірних температурах припиняється. Наприклад, синтез білків облігатним психрофілом Pseudomonas зупиняється при 22,5 ° С. Аналогічно в умовах безперервного культивування в хемостаті швидкість синтезу білків цим же організмом швидко падала при температурі близько 20 ° С. У цих умовах переставав синтезувати білки і одночасно втрачав життєздатність А4 cryophilus.

Слід зазначити, що температури, при яких відбувається денатурація рибосом психрофільних мікроорганізмів, набагато більша, ніж верхня межа зростання цих організмів. Разом з тим існує позитивна кореляція між температурою денатурації рибосом або рРНК і максимальною температурою зростання різних психрофілів. Таким чином, важко сказати чи має такий взаємозв'язок пряме відношення до верхньої температурної межі росту психрофільних мікроорганізмів. Характер фізичних змін рибосом під дією нагрівання не завжди знаходиться в прямій залежності з максимальною температурою зростання психрофільних мікроорганізмів. На відміну від дії підвищених температур на структуру рибосом на їх функціонування у психрофільних мікроорганізмів впливають температури набагато більш близькі до температур верхньої межі зростання. Рибосоми психрофілів можуть втратити активність при температурах, які мало відрізняються від максимальної температури росту мікроорганізму, хоча зростання при цьому ще можливе.

Вплив відносно невисоких температур може призводити до модифікації структурних компонентів мікроорганізмів, що ростуть при низьких температурах. Іноді відбуваються істотні зміни тонкої структури мікроорганізмів. В інших випадках спостерігаються фізіологічні порушення, викликані структурними змінами. Температура може також викликати ультраструктурні зміни у В.psychrophilus. Клітинні стінки цього психрофіла швидко руйнувалися при 40 ° С, що супроводжувалося злипання клітин та їх загибеллю. Модифікація структури клітин психрофілів під дією температури може позначатися і на їх зовнішньому вигляді. Крім безпосередньо спостережених або вимірюваних змін клітинної структури при дії відносно помірних температур з виділення внутрішньоклітинних речовин або справжньому повного лізису можна виявити модифікацію таких структур, як структури, відповідальні за проникність. Облігатний психрофіл Candida nivalis виділяє в навколишнє середовище різні внутрішньоклітинні розчинні сполуки: амінокислоти або короткі поліпептиди, неорганічний фосфат і нуклеотідмонофосфати. Виділення цих сполук не може бути викликано лізисом клітин, так як загальна кількість клітин, визначена прямим рахунком або за мутності, при цьому не зменшується. Далі, оскільки виділення з клітин білка і нуклеїнових кислот не виявлено, можна припускати, що клітинна мембрана піддається специфічній модифікації. Виділення названих вище сполук корелює із втратою клітинами життєздатності при 25 ° С; не виключено, що низька максимальна температура зростання цього мікроорганізму принаймні частково пояснюється термолабільністю клітинної мембрани.

Під дією відносно помірних температур може відбуватися лізис клітин психрофілів, а не тільки виділення з них з'єднань. Так, наприклад, цілі клітини В.psychrophilus зазнають лізис в калій-фосфатному буфері, рН 6,5 при температурах вище 28 °С. Чутливість ферментів деяких психрофільних мікроорганізмів до відносно помірних температур може бути причиною (чи однією з причин) того, що ці організми відрізняються низькою максимальною температурою росту. Зважаючи на це пояснення, слід, однак, враховувати ту обставину, що фермент може інактивувати під дією температури тільки у виділеному стані, але не в інтактних клітинах. Іноді цілісність клітини забезпечує повний або частковий захист активності термолабільних ферментів. Наприклад, малатдегідрогеназа в екстрактах клітин облігатного психрофіла V.marinus MP-1 легко інактивується при нагріванні. Активність цього ферменту знижувалася навіть при 0 ° С і майже повністю зникала в результаті інкубації протягом 10 хв при 30 ° С, тобто при температурі, що перевищує максимальну температуру росту. Аналогічну інактивацію зазнавав очищений в 20 разів препарат цього ферменту. Разом з тим, при температурах нижче оптимальної температури росту активність малатдегідрогенази в інтактних клітинах не змінювалася; отже, в цих температурних межах її захист забезпечується цілісністю клітин. Проте при температурах вищих оптимальної (15 °С) активність цієї дегідрогенази значно знижується навіть у інтактних клітинах даного психрофільного організму. Таким чином, чутливість цього ферменту до відносно низьких температур може служити причиною низького верхньої температурної межі зростання бактерій.

У інших психрофільних мікроорганізмів термолабільні ферменти виявляються зовсім не захищеними навіть у інтактних клітинах. Швидкості окислення глюкози і ендогенних субстратів зруйнованими клітинами В.psychrophilus змінювалися при зростанні температури від 5 до 45 ° С так само, як і в інтактних клітинах. Крім того, як показало порівняльне дослідження безклітинних препаратів інтактних клітин цього психрофільного організму і мезофільні штаму Bacillus, у психрофіла активність окислення глюкози пригнічувалась більшою мірою при низькій температурі.

Психрофільні гриби також містять термолабільні ферменти, від яких може залежати верхня межа зростання цих організмів. Швидкість ендогенного метаболізму сніжної цвілі Typhula idahoensis знижується при 20 °С - температурі, що пригнічує зростання.

У деяких психрофільних мікроорганізмів загальна активність і зростання пригнічується при порівняно низьких температурах через наявність тільки одного термолабільного ферменту[13].

3. Використання психрофільних мікроорганізмів в промисловості

Новітні досягнення в області науки і техніки дозволили використовувати, особливості психрофільних мікроорганізмів. Спектр такого використання досить широкий, від отримання специфічних термолабільних ферментів, до проектування водо - та грунтоочисних споруд. Хоча потенціал використання психрофільних організмів досить значний, не дивлячись на їх температурні особливості, що ускладнюють процес їх культивування і розмноження, психрофільні мікроорганізми призводять до багатьох проблем. Прикладом таких негативних впливів є прояв редуцентних властивостей в харчовій промисловості, та підгнивання пшениці в сільськогосподарських угіддях. Таким чином, в представленій роботі буде більш детально розглянуто промислові особливості і можливості даних організмів.

3.1 Засоби для охорони навколишнього середовища

Серед основних чинників очищення морської води та ґрунту, важливу роль відіграє біологічний фактор. Для прискорення процесів очищення морських акваторій та ґрунту необхідне застосування технологій, основаних на останніх науково-технічних розробках, що забезпечують результат при відносно невеликих фінансових витратах.

Застосування біологічних препаратів прискорює процес деструкції нафти в природних умовах за допомогою нанесення на поверхню забруднених земель культур мікроорганізмів, здатних розщеплювати вуглеводні. Розроблений препарат «Біоойл-СН» застосовується у виробничих масштабах. Препарат складається з асоціації мікроорганізмів на основі мезо- та псіхрофільних штамів - деструкторів нафти, що працюють при температурі від 1 °С в широкому діапазоні кислотності середовища по деструкції різноманітних фракцій нафти в ґрунтовому і водному профілях. Всі 6 штамів, що входять до складу препарату, відносяться до родів Saccharomyces sp, Enterobacter sp., Bacillus sp. (2 види), Acinetobacter sp. (2 види) депоновані, є висновок про їх безпеку для людини і навколишнього середовища. Консорціум псіхрофільних бактерій: Acinetobacter calcoaceticus Baumann et al. штам 279 МКПМ-В-7179, Psеudomonas fluorescens Stanier et al. штам 325 МКПМ-В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chalmers штам 404 МКПМ-В-7180-призначений для очищення грунту, води, ємностей і стічних вод промислових підприємств від забруднень нафтопродуктами в північних регіонах країни за 3 - 15 °C. Селекціоновані псіхрофільні штами бактерій характеризуються високою окисної здатністю, стійкістю в тривалому безперервному та періодичному процесі, активно ростуть в прісній і морській воді. Винахід відноситься до засобів боротьби із забрудненнями грунту, води і ємностей нафтою і нафтопродуктами за допомогою спеціально підібраних асоціації псіхрофільних культур бактерій. Процес самоочищення в природних умовах Півночі, Західного Сибіру, районах, де недовгий літній період, що пов'язано з бідністю флори нафтоокислюючих бактерій, дефіцитом органіки, аерації, низькою температурою середовища, що значно ускладнює використання біологічних агентів[14].

Для очищення стічних вод від важких металів та радіонуклідів, були розроблені біологічні препарати МБК та ЗМУ. Діючою основою препаратів є гранули, що складаються із живих мікроорганізмів і необхідних для них джерел живлення. До складу препаратів входять мікробні асоціації з широким «метаболічним діапазоном». Внесення в препарати різноманітних субстратів дозволяє регулювати метаболізм мікробних асоціацій і досягати максимального ефекту очищення стічних вод від ксенобіотиків. Видове різноманіття мікроорганізмів та їх висока концентрація забезпечують одночасну реалізацію декількох незалежних механізмів детоксикації ксенобіотиків. Тому препарати МБК та ЗМУ із високою швидкістю та ефективністю очищують змішані стоки, що містять суміш важких металів, радіонуклідів та органічних сполук. Препарати МБК та ЗМУ ефективно очищують розчини від металів, радіонуклідів та органічних забруднень. МБК вилучає на 98,5-99,9% важкі метали (Cu2+, Hg2+, Cd2+, Pb2+, Zn2+, CrО42- і т.д.) у діапазоні 0,006 - 10000 мг/л. МБК та ЗМУ знижують активність РРВ по сполукам 51Cr, 90Sr, 83Rb, 54Mn, 140La, 60Co - на 5-6 порядків; вилучають уран, плутоній і америцій на 99,6 - 99,9%. ЗМУ вилучає з дуже розведених розчинів рідкісноземельні та дорогоцінні метали та забезпечує глибоку доочистку стоків від зникаюче малих концентрацій важких металів та органічних забруднень. Очистка РРВ на прикладі Спецкомбінату «РАДОН». До складу РРВ Спецкомбінату «Радон» входять 4 радіонукліди з активністю (Бк/кг): 137Cs (10135,7), 60Co (30,7), 22Na (79,6), 90Sr (50192). Біотехнологія передбачала очистку РРВ в періодичних та проточних умовах в касетній установці, що представлена десятьма послідовно з`єднаними циліндрами з гранульованим МБК. Схема даної установки зображена на рисунку 2.

Рисунок 2. Схема проточної установки для очистки РРВ за допомогою МБК

1 - ємність з РРВ; 2 - шланг для подачі РРВ; 3-7 - колонки з МБК; 8 - шланги сполучення колонок; 9 - шланг для подачі очищених РРВ; 10 - ємність для очищених РРВ; 11 - вентиль подачі РРВ в установку; 12 - рама для закріплення колонок[15].

3.2 Застосування і проблеми у сільському господарстві

В останні роки значно зросло застосування біологічних препаратів у сучасному сільському господарстві. Одним з перспективних напрямків застосування мікробіологічних препаратів є їх використання при закладці плодоовочевої продукції на зимове зберігання. Застосування штучного холоду - незамінна умова для продовження термінів зберігання плодово-овочевої продукції. Однак, холодильне зберігання при температурах, близьких до кріоскопічної, не виключає ураження продукції псіхрофільними мікроорганізмами. В процесі пошуку альтернативних методів захисту рослин вагому перспективу відкривають біологічні засоби захисту, які зможуть успішно конкурувати з хімічними, не маючи в той же час їх недоліків: «звикання» збудника до фунгіцидів, токсичність, накопичення в екологічних харчових ланцюгах.

Особливо перспективним є використання бактерій-антагоністів фітопатогенів при зберіганні рослинної продукції, Також було встановлено, що бактерії-антагоністи і продукти їх життєдіяльності здатні активізувати захисні реакції бульб картоплі, такі як накопичення суберіна і процеси ранової репарації У результаті багаторічних досліджень був розроблений біопрепарат комплексної дії Екстрасол. Застосування Екстрасола для обробки продовольчої картоплі призначеного для закладання на зберігання, дозволяє значно знизити втрати, що виникають в результаті розвитку фітопатогенної мікрофлори.

А що в край важливо, так це те що були проведені досліди, в результаті яких отримані данні про те що, бактерії не впливають на організм людини оскільки вони інактивуються, при потраплянні до людського організму через свою термолабільність. [17]

3.2 Застосування у харчовій промисловості

Для виробництва м'ясних виробів одним із перспективних напрямків є використання біологічно активних речовин на основі продуктів життєдіяльності мікроорганізмів. Встановлено, що мікроорганізмі, внесені з заквасками, за рахунок ферментів змінюють структуру ковбас, створюючи нові речовини, що покращують якість показників продукту. Область застосування психрофільного, галотолерантного, денітріфікуючого штаму Paracoccus dentrificans була визначена як стартова культура для посолу свинячих та яловичих копченостей. Різниця в температурних оптимумах розвитку цих мікроорганізмів дає можливість штаму ефективно редуціювати нітрат натрію до активізації молочнокислих мікроорганізмів. Це є важливим у зв'язку з тим, що молочнокіслі мікроорганізми володіють вираженим антагонізмом не тільки по відношенню до штаму Paracoccus sp., але і по відношенню до самого процесу денітріфікації за рахунок зниження рН. При цьому у сировині накопичується окис азоту, яка в умовах подальшого зниження рН забезпечує найбільш сприятливі умови для реакції кольоростворення.

Розробка Датського м'ясного інституту - стартова культура Moraxella penylpyruvica цікава з точки зору ароматостворення. Це психрофільна культура - факультативний анаероб, що дозволяє їй активно розвиватися в товщі продукту і як показали дослідження, продукувати попередника аромату. Американські технологи, поряд з традиційними бактеріями, такими як Lactobacillus та Pediococcus, в склад стартових культур включають Micrococcus, який володіє здатністю відновлювати нітрати та нітрити, при цьому покращують смак і колір готових ковбасних виробів.

Японські дослідники виділили з психрофільного бактеріального штаму, ізольованого з проб води в Антарктиці, термолабільну фосфатазу, а з галофільного штаму Pseudomonas sp. - протеазу, яка проявляє максимальну активність при 18% концентрації NaCl в середовищі. Цей фермент використовується для приготування рибного соусу.

4. Обладнання для культивування психрофілів

Обладнання яке потрібне для культивування психрофільних мікроорганізмів, значно не відрізняється від типових вже розроблених біореакторів, оскільки процес регулювання температури, не є складним з точки зору апаратурного забезпечення. Тому більшу увагу треба приділити таким аспектам як аерація та перемішування.

Однорідність перемішування повинна забезпечити відсутність градієнтів в середовищі по температурі, рН, концентрації субстрата та продукту. В той же час необхідно враховувати небезпеку травмування в процесі перемішування. Типовий спосіб перемішування здійснюється за рахунок застосування гвинтового перемішуючого пристрою з великим діаметром та невеликою швидкістю обертання. Пневматичне перемішування в аерліфтних реакторах або гідравлічне перемішування за допомогою зовнішнього насоса також дозволяє вирішити цю проблему при роботі з культурами клітин.

Для запобігання утворенню піни і зниження ризику травмування клітин бульбашками повітря використовують менший обсяг повітря, що подається, площі аерації або застосуванням системи подачі повітря «вільного від бульбашок». При скороченні обсягу повітря, що подається, необхідно збільшити об'ємну долю кисню в газовій суміші, що подається. Для цього застосовують системи змішування газів (повітря, азот, кисень, вуглекислий газ) для забезпечення оптимальних умов.

Культивування клітин може здійснюватися в режимах періодичному (batch), з підживленням (fed-batch) і безперервному. Періодичне культивування характеризується зростанням клітин без подачі додаткових порцій субстрату після посіву культури. Ліміт субстрату або утворення токсичних компонентів можуть призвести до зниження продуктивності процесу. Для запобігання негативним наслідкам ліміту субстрату застосовується техніка культивування з підживленням, при цьому субстрат або інші необхідні компоненти додаються або безперервно, або по сигналу від датчика. При інгібуванні зростання продуктами метаболізму (лактат, амоній) використовується безперервне культивування, де в ході процесу відбувається відбирання середовища з доливанням компенсуючого об'єму свіжого середовища. Оскільки низька швидкість росту є одним з лімітуючих чинників при культивуванні психрофілів безперервний процес необхідно вести із затриманням біомаси і недопущенням її віднесення з вихідними об'ємами культуральної рідини.

Висока щільність культури забезпечить високу швидкість процесу при безперервному культивуванні. Затримання клітин можливо здійснити за рахунок вживання адекватної системи фільтрації.

Багато клітин можуть зростати лише прикріпленими до поверхні. Такі культури вимагають прикріплення до мікроносіїв таких як: скло, целюлоза, декстрин, колаген, желатин або пластик. Якщо носій має пори, клітини можуть зростати всередині носія тим самим, знижуючи негативний вплив перемішування і повітряних бульбашок.

Висновки

Отже виходячи з вище зазначеного можна впевнитися, що психрофільні організми мають поширене використання. А також мають перспективи в застосуванні в місцях з холодним кліматом, або нестабільними погодними умовами, в генній інженерії, та біохімії. Процеси культивування психрофілів, менш матеріально та енерговитратні, оскільки не потребують підтримування високої температури. Також вони є альтернативним джерелом специфічних ферментів та білків, а також антибіотиків. Все це говорить про доцільність розглянутого питання. Роботу виконано згідно ДСТУ 3008-95.

Перелік використаних джерел літератури

1. «Экология бактерий» Б.В. Громов, Г.В. Павленко Санкт-Питербург 1989

2. «Возмутители спокойствия» Д. Назаров Москва 2001

3. http://medbiol.ru/medbiol/microbiol/000bfa27.htm

4. «Введние в природоведческую микробиологию» Г.А. Заврзин Н.Н. Колотилова Москва 2001

5. «Молекулярные аспекты адаптации прокариот» Е.В. Ермилова

Санкт-Питербург 2007

6. «Лекции по природоведческой биологии» Г.А. Заварзин Москва 2003

7. «Methods for Psychrophilic Bacteria» JP Bowman London 2001

8. «Psychrobacter okhotskensis, a lipase-producing facultative psychrophile isolated from the coast of the Okhotsk Sea» Isao Yumoto 2003

9. «PSYCHROPHILIC METHYLOTROPHIC BACTERIA IN ANTARCTIC REGION BIOTOPE» V.A. Romanovskaya, P.V. Rokitko O.B. Tashirev, S.O. Shilin, N.A. Chernaya Kiev 2006

10. «Bacterial diversiry of soil samples from the western of Himalayas» Pooja Ganwar, Syed Inteyaz Alam, Sunita Bansod, Lokendra Singh 2008

11. «Sub-zero survivors» Fox, Douglas 2006

12. «Адаптация микроорганизмов к низким температурам» С.П. Лях Москва 1976

13. «Cold adapted Archaea» Cavicchioli, R. 2006

14. «КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER CALCOACETICUS, PSEUDOMONAS FLUORESCENS, ALCALIGENES FAECALIS ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ» Биттеева М.Б., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н.,

15. «Очищення промислових стічних вод на основі термодинамічного прогнозування взаємодії мікроорганізмів з металами та радіонуклідами» О.Б. Таширев Киев 2005

16. Косогорова Э.А. защита полевых и овощных культур от болезней. М.: Росагропромиздат. 1991

17. Коршунова А.Ф. и др. Корневые гнили зерновых в Сибири. - Л.: Колос, 1974

18. http://www.fermenter.ru/content/page_175_0.html

Страницы: 1, 2