Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование
. Оценка числа копий по кинетике реассоциации ДНКБолее точную информацию о числе копий можно получить, исследуя кинетику реассоциации ДНК. Кинетические методы стали применяться в этой области по крайней мере на десять лет раньше методов, описанных в разд.7.5. а, и именно с их помощью были получены первые данные о том, что эукариотические геномы содержат много повторов. Для того чтобы понять суть кинетического метода, необходимо вывести несколько уравнений.Скорость реассоциации отдельных комплементарных цепей в растворе зависит от концентрации ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. ЕслиС0 и С-это суммарные концентрации денатурированной ДНК в момент времени t0 и в момент времени t после начала гибридизации соответственно, то скорость реакции описывается уравнениемХотя, чем больше размер генома, тем меньше истинная концентрация каждого гибридизующегося фрагмента. Другими словами, в более сложном геноме каждый гибридизующийся фрагмент составляет меньшую часть суммарной ДНК и поэтому гибридизуется при более высоких значениях Cot. Таким образом, кинетические кривые позволяют оценить размер генома, если у нас имеется препарат геномной ДНК известного размера, который может служить стандартом, и если кривые соответствуют кинетике второго порядка. Если Na и Nb-размеры геномов а и b, тогде С - число молей мононуклеотидов на 1 л, t - время в секундах.Величина обычно обозначается словом, которое пишется и произносится как "Cot".Как и во многих экспериментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала Cot логарифмическая; это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений Cot, охватывающий два порядка величины.Конкретные значения Cot0.5 зависят от общего размера генома, поскольку С - это суммарная кон-Характер кинетических кривых второго порядка для ДНК SV40, Т4 и E. coli позволяет сделать вывод о том, что каждый геномный сегмент представлен в геноме только один раз. Аналогичные кривые для эукариотической геномной ДНК имеют более сложную форму. В качестве примера приведены данные для ДНК Drosophila. Гибридизация протекает в широком диапазоне значений Cot, поскольку многие сегменты ДНК повторяются, причем одни из них многократно, другие менее часто, а третьи - лишь несколько раз. Те сегменты, которые встречаются в геноме только один раз, имеют низкую концентрацию и гибридизуются при самых высоких значениях Cot. Большинство высокоповторяющихся последовательностей, концентрация которых наиболее высока, гибридизуются очень быстро и характеризуются самыми низкими значениями Cot. Предположив, что гибридизация сегментов ДНК, представленных в единственном числе, следует кинетике второго порядка, можно из сложных Cot-кривых с помощью метода наименьших квадратов выделить отдельную кривую для однокопийной последовательности и оценить ее Cot.Для таких последовательностей Drosophila значение Cot05 равно 28,6 моль"с/л при экспериментальных условиях, которые использовались в случае. Это значение принято за стандартное; сравнивая с ним значение Cot0.5 для какого-то клонированного фрагмента ДНК Drosophila, можно рассчитать число копий этого фрагмента по формуле.Вторая кривая относится к гибридизации клонированного фрагмента в присутствии суммарной геномной ДНК Drosophila. Клонированный фрагмент помечен радиоизотопом, благодаря чему кинетику его гибридизации можно регистрировать отдельно. Заметим, что концентрация фрагмента достаточно мала, так что его самогибридизацией можно пренебречь. Эффективная концентрация клонированной последовательности обеспечивается соответствующими последовательностями геномной ДНК. Поэтому значение C0t по оси абсцисс, используемое для получения значения Cot для фрагмента, рассчитывается из концентрации геномной ДНК Drosophila, а С и С0 по оси ординат относятся к фракции клонированной ДНК, которая гибридизовалась. Вот почему значения C0t действительно относятся к геномной ДНК. Значение Cot0.5 для клонированной последовательности равно 1,06, а число копий составляет 28,6/1,06 = 27.Для определения числа копий от одной до десяти этот метод малопригоден, поскольку для достижения высоких значений Cot требуется длительное время или очень высокие концентрации ДНК. Эта проблема еще более усложняется, если геном имеет большой размер, поскольку увеличивается значение Cot0 5 для однокопийных сегментов. Значение Cot0 5 для таких последовательностей в геноме Drosophila, имеющем размер 1,7*108 пар нуклеотидов, равно 28,6, а соответствующее значение Cot0.5 для генома млекопитающих по меньшей мере в десять раз выше.На самом деле кинетический анализ гибридизации несколько более сложен, чем это здесь представлено. Скорость гибридизации зависит не только от концентрации ДНК, но и от температуры, ионной силы, вязкости раствора и размера гибридизующихся фрагментов. Все эти параметры должны быть строго фиксированными.Процент гибридизовавшейся ДНК измеряют разными способами. Во-первых, можно использовать тот факт, что при определенных условиях с гидроксилапатитом связывается дуплексная, но не одноцепочечная ДНК. Во-вторых, можно определять в разные моменты времени процент ДНК, которая становится устойчивой к нуклеазе, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК. Результаты, получаемые с помощью этих двух методов, различаются, если анализируются сложные эукариотические геномы. Нуклеазный метод позволяет определять только количество дуплексной ДНК, образовавшейся при реассоциации, а метод осаждения на гидроксилапатите дает не только количество дуплексной ДНК, но и ДНК с неспаренными одноцепочечными хвостами. Такие дуплексы образуются, в частности, в результате случайных разрывов одиночных цепей еще до реассоциации с образованием фрагментов подходящих размеров, а также благодаря наличию повторяющихся последовательностей. Нуклеаза S1 расщепляет все одиночные нереассоциировавшие цепи, а также все одноцепочечные концы дуплексов. Гидроксилапатит связывает все дуплексные цепи, включая и цепи с одноцепочечными хвостами, и поэтому дает более высокую оценку доли гибридизовавшихся цепей, чем нуклеазный метод. Иными словами, в опытах с применением гидроксилапатита мы получаем большую степень реассоциации ДНК и большую скорость реассоциации, чем в опытах с 81-нуклеазой. Эти различия уменьшаются, если используются относительно короткие фрагменты ДНК.в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщенияЕще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.Изменение клонированных сегментов: получение мутантова. Общие положенияВ основе классического генетического анализа лежит получение случайных мутаций, вызывающих наследуемые фенотипические изменения. Разработка новых молекулярно-генетических методов привела к созданию так называемой обратной генетики. В охарактеризованные клонированные гены вносят специфические мутации и затем устанавливают корреляцию между изменениями в определенных участках этих генов и изменением фенотипа или локализуют регуляторные элементы. Например, если в кодирующую часть гена внести мутации, то на нем будет синтезироваться модифицированный полипептид. Это позволяет изучать влияние аминокислотной последовательности белка на его кон-формацию или ферментативную активность. Аналогично нуклеотидная замена в предполагаемом регуляторном участке может привести к подавлению или стимуляции транскрипции, что подтвердит предположение о функциональной роли данного участка.Существуют разные способы внесения мутаций в клонированные фрагменты или небольшие геномы, но мы рассмотрим лишь немногие из них. Во всех случаях успех зависит от двух условий. Во-первых, должна быть хорошо известна структура исходной ДНК. Как минимум, необходимо знать подробную карту сайтов рестрикции, но еще лучше, если известна вся последовательность изучаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все методы дают некую смесь продуктов, нужный элемент следует очистить с помощью клонирования, амплифицировать и охарактеризовать. При некоторых типах мутагенеза мутации образуются в случайных местах, при других - в определенных сайтах; о последних говорят как о сайт-специфических мутациях.б. Делеционные мутантыИспользование рестриктирующих эндонуклеаз. Внести делецию в определенный участок можно в том случае, если клонированный фрагмент ДНК содержит два близко расположенных уникальных сайта рестрикции в интересующей нас области. После эндонуклеазного расщепления фрагмента образующиеся "хвосты" отщепляют с помощью специфичной к одноцепочечным участкам нуклеазы и тупые концы вновь сшивают. Однако столь простой подход применим лишь в редких случаях. Чаще используют другой метод, при котором делецию создают в окрестности одного уникального сайта рестрикции. После эндонуклеазного разрезания фрагмента соседние нуклеотиды удаляют с помощью эндонуклеазы Bal 31 или какой-либо экзонуклеазы, например ехоШ E. coli, совместно с нуклеазой S1. При последующем лигировании образуется семейство молекул с делециями, расположенными вокруг исходного эндонуклеазного сайта. Делеционные мутанты очищают с помощью молекулярного клонирования. В одном из вариантов этого метода перед образованием кольцевой молекулы к концам присоединяют рестриктазные линкеры. При этом в молекулу вводятся эндонуклеазные сайты, которые могут оказаться полезными для исследования ее свойств, секвенирования и последующего моделирования.При помощи более сложных манипуляций может быть получен целый набор делеций разной длины, берущих начало от одного исходного сайта. Для этого рекомбинантную молекулу обрабатывают двумя способами. Из одной ее части удаляют с помощью двух рестриктирующих эндонуклеаз большой сегмент, включающий мишень для делеций. Вторую часть линеаризуют с помощью одного из двух ферментов и затем обрабатывают ферментом Bal 31. Далее в результате разрезания вторым ферментом получают набор фрагментов уменьшающейся длины. Лигирование этих фрагментов с частью А и последующее клонирование дает набор молекул с делециями, начинающимися в сайте RE1.Использование неспецифических эндонуклеаз. В сверхспиральные кольцевые молекулы могут быть внесены единичные разрывы с помощью неспецифических эндонуклеаз, например ДНКазы I. При этом образуется целый набор линейных молекул с разрывами в разных сайтах. После внесения разрыва и расширения делетированной области осуществляют лигирование с помощью методов, описанных ранее для устранения эндонуклеазных разрывов. При таком подходе используют некоторые интересные свойства ДНКазы I: в присутствии Мп2+ этот фермент расщепляет сразу обе цепи дуплексной ДНК, а в присутствии Mg2+ гидролизует за один раз только одну цепь, в результате чего в ДНК появляются одноцепочечные пробелы. Кроме того, фермент расщепляет сверхспиральную ДНК быстрее, чем линейную дуплексную, вследствие локальной неупорядоченности ДНК в сверхспиральном состоянии. Поэтому после непродолжительной обработки сверхспиральной ДНК ДНКазой I в присутствии Mg2+ образуются в основном полноразмерные линейные дуплексные молекулы. Обработка их с помощью Bal 31 или экзонуклеазы, а затем 81-нуклеазы расширяет образовавшийся ранее пробел. После лигирования отдельные продукты можно получить с помощью молекулярного клонирования.в. Инсерционные мутантыПринципы конструирования инсерционных мутантов сходны с описанными выше для делеционных мутантов. Клонированный сегмент ДНК расщепляют по одному из сайтов с помощью рестриктирующей эндонуклеазы или неспецифической эндонуклеазы. При необходимости заполняют пробелы на концах образовавшейся линейной молекулы или отщепляют одноцепочечные "хвосты" с помощью нуклеазы и осуществляют лигирование в присутствии сегмента, который хотят встроить в молекулу. В качестве вставки может использоваться синтетический фрагмент, содержащий множество сайтов для рестрикционных эндонуклеаз, - так называемый полилинкер. Если первое расщепление было неспецифичным, то появление новых сайтов рестрикции в наборе клонированных мутантов поможет построить физическую карту мутаций.г. Точечные мутацииХимический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработке сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в структуру дуплекса. При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ получения дуплексной молекулы с пробелом состоит в использовании векторной системы на основе фага М13. Для этого создают одноцепочечный М13-рекомбинант, содержащий нужный сегмент, а также другой, двухцепочечный, рекомбинант, содержащий такой же сегмент, но с делецией. Этот двухцепочечный рекомбинант денатурируют и реассоциируют с одноцепочечным, в результате чего образуется гетеродуплекс с пробелом.Если ДНК, содержащую одноцепочечный пробел, обработать бисульфитом натрия, то в одноцепочечном участке произойдет дезаминирование остатков цитозина с образованием урацила, т.е. дезаминируются только определенные остатки цитозина. Если пробел невелик, а число дезаминированных остатков цитозина ограничено благодаря малому времени реакции и низкой концентрации бисульфита, то возникает очень небольшое число специфических мутаций. Далее пробел заполняют с помощью ДНК-полимеразы и осуществляют лигирование. Вместо исходных С"С-пар в молекуле ДНК теперь содержатся пары и"А, которые после репликации превращаются в Т"А-пары.Мутагенное копирование. Специфические мутации другого типа можно получить, если при заполнении пробела вместо нормального дезоксирибонуклеозидтрифосфата использовать его мутагенный аналог. ДНК-полимераза I способна использовать в качестве субстратов различные аналоги обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Некоторые из них являются мутагенами. Например,] М6-гидро-ксидезоксицитидин-5'-трифосфат может включаться в синтезируемую цепь в положение, соответствующее А или G в матричной цепи в зависимости от того, находится ли он в иминной или аминной форме соответственно. Если пробел в дуплексной ДНК заполняется с помощью HO-dCTP вместо dTTP, то напротив А будет находиться HO-dC. После трансфекции и репликации наряду с нормальными формами будут обнаруживаться мутантные геномы с транзициями Т * А - " С * G. Проведя отбор, эти мутанты можно клонировать. Аналогично замещение dCTP на HO-dCTP приводит к транзициям С * G - > Т * А.Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олигодезоксинуклеотиды можно синтезировать в больших количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специфических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа. Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают синтетический олигодезоксирибонуклеотид длиной от 8 до 20 нуклеотидов, содержащий мутантную последовательность. Этот олигодезоксирибонуклеотид выполняет роль праймера, а оставшийся одноцепочечным участок-роль матрицы при синтезе ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы I. После копирования всей кольцевой молекулы начало и конец новой цепи соединяют лигазой. Образовавшаяся дуплексная молекула содержит неспаренные основания в мутантной последовательности. Интересно, что фаговое потомство, вышедшее из одной инфицированной клетки, сегрегирует как смешанная популяция фагов дикого типа и мутантных рекомбинантов, которые можно разделить при последующем клонировании.При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.Изучение функций клонированных сегментов ДНКНередко клонирование определенных сегментов геномной ДНК, или кДНК, осуществляют с целью выяснения функций их внутриклеточных двойников.Исходя из результатов структурного анализа клонированных последовательностей, указывающих на присутствие в них открытых рамок считывания, можно предположить, что они содержат гены. Часто удается выявить специфические промоторные последовательности и другие регуляторные элементы. Однако, чтобы подтвердить эти данные, необходимо провести прямые функциональные исследования. При этом нужно ответить на следующие вопросы:1. Транскрибируется ли данная последовательность только в одном или нескольких типах клеток? 2. Являются ли транскриптами молекулы мРНК? 3. Влияют ли на транскрипцию изменения, происходящие в клетке? 4. Содержит ли клонированный сегмент промоторы, терминаторы или другие регуляторные сигналы, и если да, то как они работают? 5. Какова связь между структурой клонированного сегмента и структурой внутриклеточных транскриптов? 6. Могут ли транскрипты транслироваться в полипептид? Для ответа на все эти вопросы используют различные экспериментальные подходы в зависимости от того, какая именно система анализируется.а. Характеристика внутриклеточных транскриптов, соответствующих клонированным сегментам ДНКГоворя о любом клонированном сегменте генома, нам прежде всего необходимо ответить на вопросы, связанные с его транскрипцией in vivo. Очень важными являются также данные о структурном сходстве между клонированной кДНК и внутриклеточными родственными транскриптами. В основе соответствующих исследований лежат три метода: РНК-блоттинг, анализ с использованием специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз и копирование РНК, выделенной из клеток, с помощью обратной транскриптазы. Все методы включают предварительное выделение и очистку РНК из целых клеток или специфических внутриклеточных органелл, таких, как ядро или цитоплазма. Результативность всех методов зависит от способности РНК образовывать гетеродуплексы с комплементарной клонированной ДНК.РНК-блоттинг. Блоттинг РНК аналогичен блоттингу ДНК. Он состоит в следующем. Выделенную РНК разделяют по размерам с помощью электрофореза в агарозном геле. Обычно электрофорез проводят в условиях, способствующих денатурации РНК, чтобы свести к минимуму влияние вторичной структуры молекулы на ее электрофоретическую подвижность. Щелочные условия для этой цели не подходят ввиду лабильности фосфодиэфирных связей в молекуле РНК в этих условиях. Поэтому используют такие агенты, как глиоксаль, формальдегид или мочевину. Затем РНК переносят на иммобилизованную подложку, стараясь сохранить распределение молекул РНК. Далее используют меченую ДНК в качестве зонда для выявления на фильтре соответствующих молекул РНК. Фильтр инкубируют с ДНК в условиях, благоприятствующих гибридизации. Промыв фильтр для удаления избыточной ДНК, с помощью радиоавтографии устанавливают положение зонда, а следовательно, и положение гомологичной РНК в том геле, в котором проводился электрофорез. Таким способом выявляют продукты транскрипции клонированного сегмента ДНК. Если на параллельной дорожке этого же геля одновременно провести разделение смеси РНК или молекул одноцепочечной ДНК известного размера, то можно оценить размер транскриптов. Кроме того, РНК-блоттинг позволяет оценить количество РНК, синтезированной в клетках, из которых она получена. Метод оценки аналогичен используемому при определении числа копий ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах. Плотность полосы на рентгеновской пленке пропорциональна количеству присутствующей гомологичной РНК. Как и ранее, желательно, чтобы меченый зонд был одноцепочечным, поскольку он не должен реассоциировать с комплементарной цепью ДНК вместо РНК.С помощью всех этих довольно простых методов можно получить обширную информацию о функциональных свойствах клонированного сегмента ДНК. Сюда относятся не только данные о способности к транскрибированию, но и оценка числа траскриптов и ее зависимость от типа клеток или внеклеточной среды. Анализируя РНК из очищенных клеточных компонентов, можно установить, где локализуются разные транскрипты - в ядре, цитоплазме или полисомах. Часто очень важным является вопрос о полиаденилировании гомологичной РНК, поскольку полиаденилирование является характерным признаком большинства эукариотических мРНК. Разделить полиаденилированную и неполиаденилированную] РНК не составляет труда, поскольку полиаденили-рованная РНК спаривается при соответствующих условиях с poly или poly. Сами полимеры обычно фиксируют на инертной твердой подложке, что упрощает отделение несвязанной poly-PHK. Фракцию poly-PHK элюируют при денатурирующих условиях. Затем РНК из каждой фракции подвергают электрофорезу, блоттингу итестированию на способность гибридизоваться с клонированной ДНК. Если РНК, идентифицированная с помощью клонированной ДНК, выделена из цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего она представляет собой мРНК. Идентификация становится более надежной, если, кроме того, РНК связана с полисомами.Еще одной характеристикой мРНК, гибридизовавшихся с клонированным сегментом ДНК, является их размер. Иногда РНК имеет больший размер, чем клонированный сегмент; это означает, что в клоне представлена лишь часть гена. В других случаях РНК оказывается короче клонированного сегмента, что свидетельствует о наличии в клонированной последовательности дополнительных последовательностей, не представленных в транскрипте. Это могут быть геномные последовательности, фланкирующие транскрибируемую область, или не-кодирующие последовательности, прерывающие кодирующую область и подвергающиеся сплайсингу во время созревания мРНК. Все эти взаимоотношения между клонированным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК можно установить более точно, используя специфичные к одноцепочечным ДНК нуклеазы или осуществляя обратную транскрипцию.
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
