Природа, морфология и основные свойства бактериофагов. Механизм действия их на бактериальную клетку. Применение их в диагностике, лечении и профилактике болезней

Частицы (или вирионы) большинства известных фагов имеют форму сперматозоида. Они состоят из головки (или капсида) и отростка. Наряду с этим есть фаги, которые состоят из одной головки, без отростка, и фаги, имеющие форму палочки (палочковидные или нитевидные фаги).

По форме частиц фаги делятся на шесть основных морфологических типов (групп): (рис.2) палочковидные или нитевидные фаги; фаги, состоящие из одной головки, без отростка; фаги, состоящие из головки, на которой имеется несколько небольших выступов; фаги, состоящие из головки и весьма короткого отростка; фаги, имеющие головку и длинный отросток, чехол которого не может сокращаться; фаги, имеющие головку и длинный отросток, чехол которого может сокращаться.

Иллюстрация 4: Фаги 2 морфологического типа, частица состоит из одной головки. Увел. X 600 000

Размеры фагов принято обозначать в милли-микрометрах (1 миллимикрометр -- миллионная часть миллиметра) или в ангстремах (10 А = 1 миллимикрометр).

Фаги первого морфологического типа -- палочковидные или нитевидные -- выявлены у кишечной, синегнойной, чудесной палочек и других бактерий. Средние размеры их: длина -- от 7000 до 8500 А, ширина -- от 50 до 80 А (рис. 3). Эти фаги отличаются от всех остальных не только большой специфичностью, но и рядом других важных свойств.

Фаги второго морфологического типа. Частица их состоит из одной головки гексагональной (шестигранной) формы на плоскости. Частицы очень мелкие, средний размер их 230--300 А в диаметре (рис. 4).

У фагов третьего морфологического типа форма и размеры головки такие же, как у фагов второго типа, но у их головок имеются обычно несколько очень коротких выступов (рис. 5). Возможно, эти выступы являются аналогами отростков.

Иллюстрация 5: Фаги третьего морфологического типа от головки отходят небольшие выступы

Иллюстрация 6: Фаг 4 морф. типа. Частица состоит из головки и короткого отростка Увел. х500 000

Фаги 2-го и 3-го морфологических типов отличаются постоянством формы и размеров, независимо от того, против каких микроорганизмов они активны. Эти фаги относятся к мелким формам.

Фаги 4-го морфологического типа. Частица состоит из головки, размеры которой варьирую от 400 до 640 А в диаметре, и очень короткого отростка (рис. 6).Длина и ширина отростка от 70 до 200 А.

Фаги пятого морфологического типа наиболее широко распространены. Головка у частиц гексагональной, формы различных размеров -- от 500 до 4250 А в диаметре. Размеры отростка: длина -- от 1700 до 5000 А, ширина -- от 70 до 120 А (рис. 7). Чехол отростка не способен сокращаться.

Фаги шестого морфологического типа также широко распространены. Головка частицы различной формы и размеров -- от 600 до 1500 А в диаметре, гексагональная. Размеры отростка: длина -- от 800 до 2890 А, ширина -- от 140 до 370 А. Важной особенностью фагов этой группы является то, что чехол, окружающий отросток, способен сокращаться, в результате чего становится видимым внутренний стержень отростка (рис.8).

Головки всех фагов состоят из внутреннего содержимого -- нуклеиновой кислоты - и окружены белковой оболочкой. Отросток фагов весьма сложен. Он обычно состоит из следующих структур: наружного чехла (или оболочки), внутреннего стержня с канальцем, базальной пластинки, оканчивающейся выступами (типа шипов) и нитевидными структурами. Чехол отростка состоит из субъединиц белковой природы, собранных в спираль. В результате этого он приобретает вид гофрированной трубки. В верхней части отростка многих фагов имеется образование, которое называется воротничком. На рисунке 9 схематически изображена тонкая структура фаговой частицы.

Изучение химического состава фагов стало возможно лишь тогда, когда были усовершенствованы методы получения в больших количествах очищенных препаратов фага. В настоящее время изучен химический состав фагов, принадлежащих к разным морфологическим типам и поражающих микроорганизмы почти всех систематических групп.

Иллюстрация 7: Разные фаги пятого морфологического типа, частица состоит из головки и длинного отростка, чехол которого не способен сокращаться. 1,2- увел. X 225 000, 3 - увел. X250 000

Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты -- дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются от микроорганизмов, содержащих в клетках оба типа нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%).

Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от типа своей нуклеиновой кислоты фаги делятся на ДНК-овые и РНК-овые. Количество белка и нуклеиновой кислоты у разных фагов разное. У некоторых фагов содержание их почти одинаковое и каждый из этих компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно.

Иллюстрация 8: Фаг шестого морфологического типа, частица состоит из головки и длинного отростка, чехол которого способен к сокращению. Увел, около 400 000.

Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые преимущественно нейтральные жиры.

Иллюстрация 9: Схема строения фаговой частицы.

Все известные фаги второго морфологического типа РНК-овые. Среди фагов третьего морфологического типа встречаются как РНК-овые, так и ДНК-овые формы. Фаги остальных морфологических типов -- ДНК-овые.

Известно, что при введении в организм животного подкожно или внутривенно белка, бактериальных клеток, некоторых продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и других веществ в крови животного вырабатываются вещества, названные антителами. Вещества, способные вызывать образование антител, называются антигенами.

Антитела очень специфичны и способны вступать в реакции только с теми антигенами, которые вызвали их образование. Они или связывают соответствующие антигены, или нейтрализуют их, или осаждают, или растворяют.

Оказалось, что все фаги обладают антигенными свойствами. При введении фага в организм животного в сыворотке крови образуются специфические антитела, способные действовать только против данного фага. Такие сыворотки называются антифаговыми. Когда фаг смешивается со специфической антифаговой сывороткой, происходит инактивация фага -- фаг теряет способность вызывать лизис чувствительных к нему микробов.

Так как каждая антифаговая сыворотка специфична, ее можно успешно применять для идентификации и классификации фагов и очистки микробной культуры от фага. При помощи сыворотки удалось доказать, что белок оболочки фага отличается от белка оболочки отростка и от белка базальной пластинки и ее нитевидных образований, что говорит о сложности структуры фаговой частицы. По антигенным свойствам фаг резко отличается от чувствительных к нему микробов.

Взаимоотношения между фагом и чувствительной к нему клеткой очень сложны и не всегда завершаются лизисом клетки и размножением в ней фага. Одни бактериофаги весьма специфичны и способны лизировать клетки только одного какого-либо вида микроорганизмов (монофаги), другие -- клетки разных видов (полифаги). Рассмотрим такую инфекцию клетки, которая заканчивается гибелью клетки и размножением в ней фага. Такая инфекция называется продуктивной.

Важнейшей особенностью размножения фага является то, что оно может происходить только в живых клетках, находящихся в стадии роста.

В мертвых клетках, а также продуктах клеточного обмена размножение фага не происходит.. По характеру взаимодействия с микробной клеткой различают вирулентные и умеренные Б. Процесс взаимодействия вирулентного Б. с клеткой весьма сложный и состоит из следующих последовательно протекающих этапов (рис. 10): 1) адсорбция фаговой частицы на поверхности микробной клетки; 2) проникновение содержимого головки фаговой частицы (нуклеиновой кислоты) в микробную клетку; 3) внутриклеточное развитие фага, заканчивающееся образованием новых фаговых частиц; 4) лизис клетки и выход из нее новых фагов.

Время с момента инфицирования клетки фагом до лизиса клетки называется латентным или скрытым периодом. Продолжительность этого периода различна для разных типов фага, зависит от окружающей температуры, состава среды и других факторов. Латентный период фагов, специфичных для одних бактерий, 15--40 мин, для других -- 5 ч и более. У фагов актиномицетов латентный период может быть еще продолжительнее. При низкой температуре латентный период значительно увеличивается.

Иллюстрация 10: Схема размножения фага.

Иллюстрация 11: Адсорбция фага на клетке

Из всех этапов размножения фага наиболее изучен первый -- адсорбция.

Адсорбция фага на клетке -- реакция весьма специфичная. В клеточной стенке бактерий имеются особые структуры (рецепторы), к которым могут прикрепиться фаги. Адсорбируются на рецепторах только те фаги, к которым чувствительна клетка.

Фаги, имеющие отростки, прикрепляются к микробной стенке свободным концом отростка. Нитевидные фаги, а также фаги, не имеющие отростков, адсорбируются не на микробной стенке, а на нитевидных структурах, окружающих стенку, -- фимбриях. Описаны фаги, которые прикрепляются отростком к бактериальным жгутикам. У некоторых фагов процесс адсорбции может осуществляться лишь в том случае, когда в среде имеются определенные вещества -- кофакторы: аминокислоты (триптофан, тирозин и др.) или соли (кальциевые, магниевые).

На конце фагового отростка имеется особый фермент типа лизоцима. После адсорбции фага под влиянием этого фермента происходит растворение стенки микробной клетки и содержимое головки фага -- нуклеиновая кислота -- перекачивается в микробную клетку. Этим завершается второй этап процесса размножения фага.

Остальные структуры фаговой частицы -- оболочка головки, отросток и его субструктуры -- внутрь инфицированной фагом клетки не попадают. Их роль заключается в обеспечении сохранности фаговой частицы, находящейся вне клетки, и содействии проникновению фаговой нуклеиновой кислоты в клетку при инфекции.

Иллюстрация 12: Мелкие (едва видимые) негативные колонии актинофага. Увел. 6:10

У нитевидных фагов, в отличие от других видов фагов, внутрь клетки проникает весь белок или его часть. После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку начинается сложный процесс внутриклеточного размножения фага. Под влиянием нуклеиновой кислоты фага резко изменяется весь обмен микробной клетки. Основные процессы, протекающие в инфицированной клетке, направлены на образование новых фаговых частиц. Инъецированная ДНК подавляет синтезирующие механизмы клетки, заставляя ее синтезировать ДНК и белки бактериофага. Из образовавшихся в разных частях клетки в разное время фаговой нуклеиновой кислоты и белка формируются новые фаговые частицы (сборка Б.). Вначале формируются отдельно головки и отростки, которые затем объединяются в зрелые фаговые частицы. К этому времени внутри клетки образуется особый литический фермент, который вызывает лизис клетки изнутри. Клетка распадается, и новые зрелые частицы фага выходят наружу.

Иллюстрация 13: Мелкие негативные колонии актинофага Увел. 8 : 9.

Количество новых фаговых частиц, образуемых одной клеткой при фаговой инфекции, называют выходом фага или его урожайностью. Выход фага зависит от свойств данного фага и не зависит от клетки-хозяина и ее размеров. Одни фаги отличаются очень низким выходом (5--50 частиц на клетку), у других выход значительно выше (от 1000 до 2500). Особенно высоким выходом отличаются мелкие РНК-овые фаги (свыше 20 000 частиц на клетку). Если большое количество бактериальных клеток смешать с небольшим количеством фаговых частиц, то процесс размножения фагов проходит несколько циклов. В начале инфицируется часть клеток. Первое потомство фага инфицирует оставшиеся клетки -- происходит второй цикл, за ним может следовать третий и т.д., пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу клетки. Среди фагов встречаются такие, размножение которых возможно лишь при наличии в среде определенных кофакторов. Одни из этих веществ, как уже указывалось, необходимы для адсорбции фага; другие -- для внутриклеточного размножения фага.

Иллюстрация 14: Негативные колонии бактериофага средней величины. Увел. 1:1

Является ли процесс размножения фага всегда смертельным для инфицированной им клетки? Несомненно, абсолютное большинство фагов вызывают при размножении лизис клетки и ее гибель. Лишь в последнее время было установлено, что при инфицировании клетки нитевидными фагами возможно размножение их без гибели клетки.

Если произвести рассев по поверхности агаризованной питательной среды в чашках Петри смеси фага и чувствительных к нему микробов и чашки выдержать в термостате, то происходит лизис клеток в результате размножения фага. Если взять большое количество частиц фага, то лизируется большая часть или весь выросший газон культуры. Если количество фаговых частиц таково, что они распределяются только на отдельных участках газона, лизируя в этих местах культуру, то возникает колония фага.

Эти колонии фага получили название бляшек, стерильных пятен. Правильнее их называть негативными колониями. Каждая негативная колония состоит из десятков и сотен миллионов фаговых частиц. Размер негативных колоний и их форма зависят в первую очередь от свойств фага, а также от состава среды и культуры микробов. У одних фагов негативные колонии очень мелкие и еле видимы невооруженным глазом, другие достигают 10 мм в диаметре и более. Колонии бывают светлые и четкие, когда лизировалась вся культура, или мутноватые, когда лизировались не все клетки. Вокруг негативных колоний некоторых фагов могут возникнуть различной формы и величины ореолы. На рисунках 12-- 16 показаны негативные колонии разных фагов.

Морфология негативных колоний служит одним из признаков, которым пользуются при дифференциации фагов.

Иллюстрация 15: Крупные негативные колонии актинофага. Увел. 1:1.

Иллюстрация 16: Негативные колонии актинофага, окруженные ореолом угнетенного роста тест-культуры. Увел. 10:8.

Лизогения и её биологическое значение

При изучении явления бактериофагии исследователи обратили внимание на то, что иногда встречаются культуры микроорганизмов, которые содержат фаги, хотя на эти культуры фагами и не воздействовали. Явление фагоносительства получило название лизогении.

Оно было описано одним из основоположников учения о бактериофагах -- Д'Эреллем, который считал, что такие культуры загрязняются фагом извне. Подобные культуры были названы ложнолизогенными.

Ложнолизогенные культуры состоят из смеси устойчивых и чувствительных к определенному фагу клеток.

Такие культуры могут быть легко освобождены от содержащихся в них фагов или путем нескольких рассевов, или с помощью специфической антифаговой сыворотки, или воздействием антифаговыми веществами.

Кроме ложнолизогенных, встречаются такие содержащие фаги культуры, у которых лизо-генное состояние, т. е. способность выделять фаги, стойко сохраняется даже после многочисленных пересевов в среде с антифаговой сывороткой и многократных воздействий антифаговыми веществами. Такие культуры названы истиннолизогенными. Мы расскажем только об этих культурах, которые будем называть лизогенными.

Лизогенными культурами являются такие культуры, которые обладают способностью продуцировать зрелые частицы фага без воздействия на них фагом извне. Это свойство стойко передается по наследству. В лизогенной культуре фаг находится внутри клетки. Для понимания сущности лизогении особо важное значение имел вопрос: в каком состоянии фаг находится внутри лизогенной клетки?

Опыты с искусственным разрывом клеток лизогенных культур под влиянием разнообразных физических и химических факторов (ультразвука, антибиотиков, литических ферментов и т. д.) не выявили наличия в клетках зрелых частиц фага.

Важное значение для понимания истинной природы лизогении имели работы А. Львова и А. Гутмана (1950). Оригинальные опыты этих исследователей убедительно показали, что в лизогенной клетке фаг находится не в виде зрелых частиц, а в какой-то другой, неинфекционной для клетки форме. Такую форму назвали профагом. Именно умеренные фаги могут находиться в лизогенных клетках в виде профага.

Клетку можно экспериментально сделать лизогенной. Такой эксперимент помог выяснить механизмы процесса, благодаря которому клетка становится лизогенной. Оказалось, что при воздействии на клетку умеренным фагом часть популяции клеток лизируется, а другая часть становится лизогенной. При этом фаг адсорбируется клеткой и его нуклеиновая кислота проникает внутрь клетки. Однако, в отличие от продуктивной инфекции, вызываемой вирулентным фагом, при лизогенизадии нуклеиновая кислота фага связывается с ядерным аппаратом клетки (хромосомой) и остается в ней в виде профага.

Вопросы локализации профага в клетке и формы его связи с клеткой являются важнейшими проблемами лизогении. По данным ряда исследователей, каждый профаг занимает определенное место на хромосоме лизогенной клетки. При делении клетки профаг воспроизводится со скоростью, равной скорости воспроизводства генетического материала клетки, что способствует передаче лизогенного состояния потомству.

Следовательно, в лизогенной клетке профаг ведет себя как ее нормальный компонент. При лизогенизации происходит объединение генетического материала клетки с генетическим материалом фага на молекулярном уровне. Известны пока единичные случаи, когда профаг не связан с хромосомой, а расположен на мембранах клеточной цитоплазмы.

Итак, в лизогенной клетке фаг является дополнительным генетическим фактором, который может неопределенно длительное время находиться внутри клетки и, как всякий генетический фактор, определять свойственные ему признаки.

Лизогенные культуры устойчивы (или иммунны) к тому фагу, который они содержат, а также к близкородственным ему фагам. При размножении лизогенной культуры какая-то часть клеток популяции лизируется и освобождает зрелые частицы специфичного для этой популяции умеренного фага.

Образование лизогенными культурами зрелых частиц фага получило название спонтанной индукции. Количество лизируемых клеток и количество образовавшихся зрелых частиц фага зависят от особенностей данной культуры и условий выращивания. В то же время количество клеток, освобождающих фаги, может быть резко увеличено при воздействии на лизогенную культуру некоторыми физическими и химическими факторами, получившими название индуцирующих. При индукции некоторых лизогенных культур удавалось вызывать образование зрелых частиц фага почти у всех клеток. К индуцирующим агентам относятся ультрафиолетовые (УФ), рентгеновские и гамма-излучения, перекиси, азотистый иприт и его гомологи, этиленимин, урацил, многие антибиотики. Наиболее эффективные и широко применяемые индуцирующие факторы -- УФ-лучи и антибиотик митомицин С.

Как отмечалось, важным свойством лизогенной культуры является ее устойчивость к содержащемуся в ней фагу. В связи с этим выделение и изучение умеренных фагов лизогенной культуры возможно лишь в том случае, когда имеется другая культура того же вида, которая чувствительна к умеренному фагу данной лизогенной культуры. Такие культуры получили название индикаторных. К лизогенным культурам, особенно широко распространенным в природе, сравнительно легко можно подобрать индикаторные культуры среди других разновидностей этого же вида.

В отдельных случаях умеренный фаг лизогенной культуры может спонтанно (без внешних воздействий) или под влиянием различных факторов измениться и стать вирулентным. Тогда фаг приобретает способность лизировать все клетки данной культуры. У некоторых лизогенных культур превращение умеренного фага в вирулентный происходит сравнительно легко. Имеется ряд культур, у которых экспериментально не удавалось превратить умеренный фаг в вирулентный.

Возможность возникновения вирулентных мутантов умеренных фагов имеет большое теоретическое и практическое значение. Не редки случаи, когда единственным доказательством лизогенности культуры является возникновение вирулентных мутантов ее умеренного фага.

Лизогения широко распространена среди всех систематических групп микроорганизмов. Это явление детально изучено у сальмонелл -- возбудителей брюшного тифа и паратифа, у дифтерийной палочки; все культуры этих видов патогенных бактерий оказались лизогенными. Лизогения широко распространена среди стрептококков, споровых форм бактерий, клубеньковых бактерий, актиномицетов, микобактерий и др.; она выявлена и у некоторых мицелиальных грибов (пенициллов) и дрожжей. Есть все основания утверждать, что абсолютное большинство микроорганизмов являются лизогенными. Ни про одну культуру нельзя с уверенностью сказать, что она не лизогенная.

За последнее время накапливается все больше данных о том, что многие лизогенные культуры содержат 2, 3, 4 и более умеренных фагов, т. е. являются полилизогенными. Например, многие актиномицеты, проактиномицеты, клубеньковые бактерии и некоторые спороносные бактерии содержат 4 и более фагов. Содержащиеся в полилизогенных культурах фаги часто резко различаются между собой по форме частиц, антигенным свойствам и спектру литического действия. Полилизогенные культуры можно экспериментально получить с помощью воздействия на них одновременно или последовательно различными умеренными фагами. Полученные таким способом культуры не отличаются от выделенных из природных источников.

Как уже отмечалось, профаг лизогенной культуры способен превратиться спонтанно или при индукции в зрелую полноценную фаговую частицу. Однако в ряде случаев под влиянием различных факторов у профага возникают стойкие наследуемые изменения (мутации), в результате которых он при индукции не способен превращаться в полноценную частицу. Поэтому у таких культур возникают частицы, состоящие только из головки или только из одного отростка. Возможны и другие нарушения в структуре фаговой частицы. При индукции таких культур лизогенная клетка лизируется, но образовавшиеся частицы как неполноценные не способны к размножению на индикаторной культуре.

Наиболее детально изучены дефектные фаги, у которых образуются одни лишь отростки. Такие фаги способны адсорбироваться на клетке, убить ее, но не могут размножаться. В последнее время такие дефектные фаги привлекли к себе внимание исследователей, так как было установлено, что многие описанные в литературе бактериоцины (вещества, убивающие бактерии) представляют собой дефектные фаговые частицы.

Существуют два принципиально различных типа бактериоцинов. Одни из них отличаются низким молекулярным весом, не осаждаются при центрифугировании, чувствительны к ферменту трипсину, термолабильны и в электронном микроскопе не видны. Бактериоцины другого типа обладают высоким молекулярным весом, осаждаются при центрифугировании, термостабильны и в электронном микроскопе видны в виде фагоподобных частиц или отдельных компонентов фаговой частицы (преимущественно в виде отростков).

О происхождении бактериоцинов первого типа и о возможной связи их с лизогенным состоянием культуры-продуцента никаких данных нет. В то же время многими исследователями показано, что образование бактериоцинов второго типа тесно связано с дефектной лизогенией продуцента.

Наиболее убедительное доказательство дефектной лизогении -- выявление дефектных фаговых частиц, количество которых значительно увеличивается при индукции.

Имеются все основания утверждать, что дефектная лизогения довольно широко распространена. Она выявлена у очень многих культур, например у актиномицета, продуцирующего антибиотик стрептомицин, клубеньковых бактерий, спороносных бактерий, применяемых для борьбы с вредными насекомыми. Выявлены дефектные фаговые частицы, обнаруженные у кишечной палочки и названные колицином. Кроме того, были выявлены и описаны полилизогенные культуры актиномицетов, которые одновременно содержали нормальные и дефектные фаговые частицы.

Страницы: 1, 2, 3