Биогенез мембран

Биогенез мембран

Биогенез мембран

Введение

Рассмотрим процесс образования мембран. Этот процесс начинается с синтеза белковых и липидных компонентов, которые затем должны быть доставлены к месту назначения. Принимая во внимание все разнообразие мембран, существующих в типичной эукариотической клетке, можно сделать вывод, что для осуществления этого процесса необходимы необычайно точные механизмы.

Обсудим вопросы биогенеза мембранных белков. В принципе имеются две главные проблемы, касающиеся сборки мембранных белков.

Все закодированные в ядре белки синтезируются общим пулом рибосом. В связи с этим возникает вопрос: как отдельные мембранные белки доставляются к месту назначения? Чем отличаются белки плазматической мембраны от белков внутренней митохон-дриальной мембраны или от белков мембран эндоплазматического ретикулума? Эту сложную проблему сортировки можно решить только при наличии определенных сигнальных последовательностей в каждом полипептиде, а также соответствующего аппарата узнавания.

Каков истинный механизм встраивания мембранных белков в мембрану и как при этом достигается правильная их ориентация относительно мембранного бислоя? Требуют ли механизмы встраивания и ориентации также наличия определенных сигнальных элементов и систем узнавания и если да, то каковы они? Какие свойства обеспечивают при встраивании мембранных белков формирование правильной третичной, а также червертичной структуры в случае мультисубъедииичных ансамблей?

За последнее десятилетие в поиске ответов на все эти вопросы достигнуты большие успехи, причем они становятся все более значительными. Это в большой мере обусловлено тем, что для выяснения роли специфических сигнальных полипептидных последовательностей в этих процессах стала использоваться рекомбинантная ДНК. Хотя не на все вопросы удалось найти ответы, полученные результаты все больше убеждают в том, что совершенно разные на первый взгляд системы в действительности обладают фундаментальным сходством. Например, не так давно было показано, что механизм секреции белков имеет много общего с механизмом синтеза белков плазматической мембраны. Совсем недавно достигнут большой прогресс в понимании общих принципов переноса белков через мембраны митохондрий, эндоплазматического ретикулу-ма и грамотрицательных бактерий. Эти экспериментальные системы изучались наиболее интенсивно. И хотя между соответствующими процессами есть значительные различия, они имеют ряд общих особенностей.

Существует идентифицируемая часть полипептидной последовательности, которая служит участком узнавания, или «сигналом», направляющим отдельный полипептид к мембране, в которую он встраивается. Эти сигнальные участки часто расположены на N-конце новосинтезированного полипептида и отщепляются специфическими сигнальными пептидазами после встраивания его в нужную мембрану или переноса через нее. Для обозначения N-концевого сигнала различными авторами использовались следующие термины: сигнальный пептид, сигнальная последовательность, транзитный пептид, лидирующий пептид, пре-последовательность.

Процессы трансляции и встраивания белков в мембрану можно разделить в эксперименте. Для сборки мембранных белков в большинстве случаев необходима энергия, отличающаяся по величине от той, которая требуется для их трансляции на рибосоме. Замечено, что in vivo трансляция и перенос часто бывают тесно сопряжены во времени.

Связавшийся с мембраной-мишенью полипептид должен, кроме того, находиться в конформации, в которой может осуществляться его перенос через мембрану или встраивание в нее. Во многих случаях перенос белков через мембраны происходит от N-конца к С-концу, при этом необходимо, чтобы белок был по крайней мере частично развернут или слабо свернут. Полипептид может транспонироваться в вытянутой форме в ходе энергозависимого процесса.

Первая группа вопросов, которые мы рассмотрим, связана с сортировкой белков во время биогенеза и сборки. На рис. 10.1 представлена схема., иллюстрирующая всю сложность этой проблемы и суммирующая данные по эукариотическим клеткам и грамот-рицательным бактериям. Доставка каждого белка к месту назначения обеспечивается иерархией сигналов, закодированных в каждом полипептиде. Например, большинство белков, предназначенных для эндоплазматического ретикулума или митохондрий, синтезируется в виде предшественников большей молекулярной массы; на N-конце у них имеется дополнительная последователь-

ность, которая отщепляется особыми протеолитическими ферментами, имеющимися в этих органеллах. Такие первичные сигналы весьма разнообразны и необходимы для того, чтобы полипептиды были узианы при транслокации специфическими рецепторами в этих органеллах. Связывание с митохондриями происходит сразу после завершения трансляции. Однако для большинства белков, направляемых в эндоплазматический ретикулум в клетках млекопитающих, наблюдается иная картина. Как видно из рис. 10.1, после связывания белков с соответствующей органеллой должна произойти дальнейшая сортировка. Для этого нужна дополнительная информация, которая также должна быть закодирована в каждой полипептидной последовательности и может рассматриваться как вторичные сигналы. В нескольких случаях их удалось идентифицировать как сигнальные последовательности, физически отделенные от первичных, хотя, возможно, так бывает не всегда. Позже мы рассмотрим характерные примеры использования этих сигналов при сортировке белков.

Особый интерес для нас представляет процесс сборки мембранных белков, который целесообразно рассмотреть в связи с их сортировкой. На рис. 2 схематически показаны три общих механизма проникновения пептидного предшественника в мембрану. Механизмы А к Б являются вариантами схемы линейного вытеснения, согласно которой сигнальная последовательность направляет полипептид к переносящему устройству, которое включает в себя заполненный водой канал. Сигнальная последовательность может проходить прямо сквозь канал или оставаться связанной с мембраной, образуя, как показано на рис. 10.2, петлю. В отсутствие какого-либо сигнала остановки процесса переноса полипептид будет транспортироваться через мембрану целиком. Однако, если внутри полипептида имеется второй сигнальный пептид, называемый стогмигналом переноса, то процесс останавливается и стоп-сигнал переноса становится трансмембранным сегментом зрелого мембранного белка. Фиксируя белок в мембране, стоп-сигнал переноса действует как сигнал сортировки. Если в белке имеются и другие сигналы начала и конца переноса, то будут образовываться следующие трансмембранные сегменты. Рис. 10.3 показывает, как сочетание нескольких видов сигналов может направлять последовательность реакций таким образом, чтобы создавалось широкое разнообразие типов упаковки встраиваемых в мембрану белков эндоплазматического ретикулума. Заметим, что сигнальные последовательности, которые не удаляются протеолитиче-ским путем, остаются в начале трансмембранных сегментов и могут использоваться для инициации транспорта фланкирующих полнпептидных доменов на N- или С-конце. К сожалению, эта простая схема не является исчерпывающей, известны примеры, когда сигналы изменяют свою функцию в зависимости от обстоятельств или когда в правильном включении в мембрану существенную роль играют взаимодействия между предполагаемыми сигналами внутри полипептида.

Схема В на рис. 10.2 иллюстрирует возможную роль самопроизвольного включения в мембрану гидрофобных элементов полипептидного предшественника. Этот механизм может реализовываться только тогда, когда включение в мембрану происходит после трансляции полипептида. Первым примером, подтверждающим существование этого механизма, является пробелок оболочки фага М13. Модель самопроизвольного включения может использоваться для объяснения механизма встраивания поперек мембраны амфифильных а-спиралей или 0-структур. Этот процесс может также, конечно, быть белокзависимым.

О координации биосинтеза мембранных липидов и белков в про карнотитеских или эукариотических клетках известно немного. Установлено, впрочем, что в нескольких случаях сверхпродукция отдельных мембранных белков приводит к разрастанию внутриклеточных мембран, содержащих липиды и в преобладающем количестве -- сверхпродуцированный белок. То обстоятельство, что пипидный состав разнообразных мембран в эука-риотической клетке существенно различается, позволяет задаться вопросом, как эти композиции липидов создаются и поддерживаются. Мы остановимся, в частности, на скорости обмена разных видов липидов между мембранами и возможных механизмах, облегчающих перенос липидов от места их синтеза к месту назначения. Наконец, известно, что липидный состав мембран многочисленных организмов варьирует при изменении внешних условий.

2. Общие особенности экзоцитозного пути

Экзоцитозным в эукариотических клетках называется путь, с помощью которого осуществляется транспорт белков, секретируемых клеткой или включаемых в наружную мембрану. Секретируемые белки синтезируются на связанных с мембранами рибосомах на ци-топлазматической поверхности шероховатого эндоплазматического ретикулума и выводятся из клетки с помощью того же механизма, который используется для включения мембранных белков в эндо-плазматический ретикулум. Если водорастворимый белок не имеет вторичных сигналов сортировки, то он транспортируется к клеточной поверхности и секретируется с помощью «конститутивного» пути. Этот путь экзоцитоза изучался с привлечением разных цитохимических методов, генетических подходов и биохимических исследований бесклеточных систем. Белки, транспортируемые этим путем, перемещаются из эндоплазматического ретикулума последовательно через различные компартменты комплекса Гольджи и в конце концов попадают на поверхность клетки. Они могут становиться компонентами цитоплазматиче-ской мембраны или, при наличии вторичных сигналов сортировки, оставаться в эидоплазматическом ретикулуме или в комплексе Гольджи. В комплексе Гольджи в ходе дальнейшей сортировки отделяются белки, секретируемые конститутивным путем, от тех, которые направляются в лизосомы или концентрируются в секреторных гранулах, с помощью которых они затем секретируются при соответствующей стимуляции клетки. Кроме того, обнаружено, что в наружной мембране ядерной оболочки также могут синтезироваться мембранные глнкопротеины, которые затем транспортируются с помощью экзоцитоза.

Белки при транспортировке по экзоцитозному пути подвергаются посттрансляционным модификациям, в частности гликозилиро-ванию. Хорошо изучена компартментация процессинга N-связанного олигосахарида, что очень помогло определению различных компонентов комплекса Гольджи. Олигосахаридный предшественник с высоким содержанием маннозы присоединяется по местам гликозилирования в полипептиде, когда белок находится внутри эндоплазматического ретикулума, а затем с помощью нескольких расположенных в различных компарт-ментах ферментов осуществляется процесс созревания. Это позволяет следить за превращением белков, определяя состояние их гликозирования. На рис. 10.5 представлен

процессинг олитосахаридного предшественника с высоким содержанием маннозы.

В исследованиях экзоцитозного пути был достигнут значительный прогресс благодаря использованию вирусов с оболочкой, в частности вируса везикулярного стоматита. Гликопротеин шиловидной структуры вируса везикулярного стоматита, называемый G-бел-ком, -- это трансмембраниый белок, который синтезируется на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, после инфекции. С помощью экзоцитозного пути G-белок попадает на плазматическую мембрану, где он участвует в образовании отпочковывающегося вируса. Инфицируя клетки этим вирусом, можно проследить за процессингом кодируемого вирусным геномом G-белка, что позволит исследовать экзоцитозный путь. Этот подход используется для идентификации везикул, участвующих во внутриклеточном транспорте, для изу-

чения влияния гликозирования на доставку белков к клеточной поверхности, для исследования энергетики экзоцитозного транспорта и, что наиболее важно, для создания бесклеточной системы везикулярного внутриклеточного транспорта.

Эти исследования выявили несколько замечательных особенностей системы экзоцитозного транспорта.

1. Транспорт между различными компартментами органеллы осуществляется с помощью везикул, которые отпочковываются от «донорной» мембраны и потом сливаются с «акцепторной». Показано, что везикулы, участвующие в транспорте между компартментами комплекса Гольджи, являются «окаймленными», но соответствующий белок отличается от клатрина, окаймляющего эндоци-тозные везикулы. Имеются веские данные в пользу того, что клатрин не является существенным компонентом экзоцитозного пути, хотя он, по-видимому, необходим для нормального роста некоторых штаммов дрожжей. Степень общности ком-

поиентов эидоцитозного и экзоцитозного путей неясна, хотя некоторые везикулы, вероятно, функционируют в обоих случаях.

Для внутриклеточного транспорта необходим АТР, а также белковые компоненты цитозоля. Показано, что для транспорта между цистернами Гольджи, осуществляющегося при участии везикул, необходимо жирнокислотное производное ацил-СоА. Какую именно функцию выполняют указанные соединения в отпочковывании и слиянии везикул, неизвестно.

Роль олигосахарида как сигнала сортировки новосинтезиро-ванных гликопротеинов, по-видимому, непостоянна. Известны случаи, когда процессинг N-концевого углевода не является необходимым для экспрессии белка плазматической мембраны на клеточной поверхности. В других системах гликозилирование существенно для доставки белка к клеточной поверхности, например, оно необходимо для включения опсина в мембрану наружного сегмента палочки сетчатки. Во многих клетках млекопитающих сигналом сортировки для белков, направляемых в лизосомы, является маннозо-6-фосфат, однако для дрожжей это не характерно. В тех клетках млекопитающих, где маннозо-фосфат функционирует как сигнал сортировки, обнаружены два мембранных рецептора с высоким сродством к гликопротеинам, содержащим маннозо-6-фосфат, и клонированы их гены. Они играют ключевую роль в процессе переноса конкретных полипептидов в лизосомы, а один из этих рецепторов существен как для эндоцитоза, так и для экзоцитоза.

Исследование бесклеточной системы, изображенной на рис. 10.6, показало, что для изучения таких сложных систем полезно использовать специфические мутанты. Выделено множество мутантных штаммов дрожжей, дефектных по разным стадиям экзоцитозного пути, и некоторые из них использовались при создании бесклеточной системы транспорта между органеллами. Оказалось, что системы дрожжей и млекопитающих весьма сходны, и для исследования последних можно с успехом использовать му-тантные штаммы дрожжей. Наконец, обнаружено, что многие вирусы с оболочкой способны отпочковываться не только от плазматических, но и от других мембран и, таким образом, могут быть полезны для изучения других аспектов внутриклеточной сортировки белков и мембранного транспорта.

Изучение внутриклеточного транспорта, осуществляемого с помощью везикул in vitro

На рис. 6 схематически представлен метод изучения транспорта вирусного G-белка между соседними компартментами комплекса Гольджи in vitro. Важной особенностью метода является то, что он позволяет определить биохимическим путем компоненты, необходимые для этого процесса. Из двух типов клеток, обозначаемых как «донор» и «акцептор», выделяют мембранные фракции, содержащие комплекс Гольджи. При этом донорную фракцию получают из мутантных клеток, у которых отсутствует фермент UDP-N-ацетилглюкозамингликозилтрансфераза I и которые были инфицированы вирусом везикулярного стоматита. Процессннг олигосаха-рида, связанного с G-белком, в этих клетках блокирован. Акцепторную фракцию получают из неинфицированных клеток дикого типа. Для присоединения Ы-ацетилглюкозамина к новосинтезирован-ному G-белку должен произойти перенос G-белка от донорной фракции к акцепторной, где необходимый фермент имеется. Количество включенного Ы-ацетилглюкозамина определяют после иммунопреципитации. Данная методика позволяет исследовать транспорт из t/uc-компартмента аппарата Гольджи в медиальный компартмент. Аналогичные работы, в которых наблюдали за присоединением сиаловой кислоты, выявили наличие транспорта in vitro между транс-элементами аппарата Гольджи.

3. Характерные особенности биосинтеза мембранных белков

Проблема сборки белков очень важна. Как мы увидим, этот процесс обычно не протекает самопроизвольно, лишь в результате взаимодействия между образующимися полипептидами и липид-ным бислоем. Напротив, он является энергозависимым и опосредуется белковыми структурами, которые пока не изучены в достаточной степени. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что перенос белков через мембрану и сборка интегральных мембранных белков -- это тесно связанные стороны одного и того же процесса. Логично ожидать, что проблемы транспортировки белков через мембраны и их укладки должны решаться одинаковым образом. Прежде чем обсуждать общие особенности сборки молекул в различных системах, полезно остановиться на методах экспериментального исследования этого процесса.

Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и про-теолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазматического ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоро-пластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli; они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе.

Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или по крайней мере через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. Как показано схематически на рис. 10.7, за ходом протеолити-ческого процессинга, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидиом геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции; при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.

В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые раство-

римые компоненты. Кроме того, при этом можно варьировать природу переносимого полипептидного «субстрата». Аналогичные исследования можно проводить in vivo с помощью метода импульсного мечения. При этом уменьшается вероятность появления артефактов, связанных с искусственностью бесклеточных систем. Убедительные данные на этот счет были получены для процесса переноса белков в хлоропласт ах и митохондриях, а также -- после длительных дискуссий -- для переноса через бак-

термальную мембрану. Долгое время считалось, что перенос белков в эндоплазматический ретикулум или через мембраны эндоплазматического ретикулума всегда осуществляется параллельно трансляции, однако в конце концов было четко показано, что такая параллельность не обязательна. По крайней мере в одном случае -- для препро-а-фактора -- наблюдался посттрансляционный транспорт в микросомы дрожжей, не зависящий от рибосом. Было также показано, что хотя у высших эукариот для переноса через эндоплазматический ретикулум элонгации белков не требуется, в большинстве случаев процесс переноса все же зависит от рибосом и происходит в то время, когда новосинтезиро-ванный полипептид еще удерживается рибосомой, Важный вывод состоит в том, что энергия, необходимая для переноса, не исходит от рибосомного биосинтетического аппарата.

Заметим, что эти данные лишь констатируют то, что процессы переноса и трансляции можно разграничить экспериментально. В клетке эти процессы тесно связаны, по крайней мере, в случае белков, транспортируемых в эндоплазматический ретикулум клеток млекопитающих, и многих белков Е. coli.

2. Энергетические требования к переносу. Как правило, перенос белков в мембраны или через них энергозависим. Необходимым условием переноса как для прокариотических, так и для эукариотиче-ских систем является гидролиз АТР. Это было показано для следующих процессов: а) переноса белков в строму хлоропластов; б) транспорта белков в митохондриальный матрикс, внутреннюю и наружную мембраны; в) переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей и пост-трансляционного встраивания мембранного белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих; г) переноса белков через цитоплазматическую мембрану E.coli. Ни в митохондриях, ни в мембранах Е. coli АТРазная активность не принадлежит АТРазе и ее роль не состоит в генерированнии трансмембранного потенциала.

Еще одним независимым условием переноса белков в матрикс митохондрий и во внутреннюю мембрану митохондрий является наличие на последней трансмембранного потенциала. Этот потенциал, очевидно, необходим на ранней стадии процесса, при связывании белка с митохондрией. Для транспорта по крайней мере некоторых белков в хлоропласт это условие не является обязательным. Однако для оптимизации переноса белков через плазматическую мембрану E.coli также нужна трансмембранная протондвижущая сила. Заметим, что направление переноса белков относительно полярности в Е. coli и митохондриях противоположно, а имеет ли мембрана эндоплазматического ретикулума трансмембранный потенциал -- неизвестно.

3. Способность предшественника к переносу. Имеются веские доводы в пользу того, что ключевую роль в успешном переносе белка играет его четвертичная структура. Скорее всего это связано с тем, что сигнальная последовательность, узнаваемая аппаратом переноса, должна быть доступна для него. Следовательно, для осуществления переноса белок должен быть неплотно свернут или частично развернут. Кроме того, если белки переносятся через мембрану в вытянутой конформации, то аппарат переноса должен быть способен к их развертыванию во время самого процесса переноса. Если бы белки-предшественники обладали стабильной четвертичной структурой, то они с трудом развертывались бы и, следовательно, не были способны к переносу.

Наиболее четкие данные о том, что белки транспортируются в вытянутой конформации, получены в работе, авторам которой удалось идентифицировать интермедиаты при переносе двух разных белков в матрикс митохондрий. Было показано, что N-кон-цы этих интермеднатов погружены в матрикс, а основная их часть находится вне митохондрии. Таким образом, интермедиаты должны протянуться через внутреннюю и наружную мембраны; при этом полагают, что место их входа совпадает с местом слияния двух мембран.

Белки могут транспортироваться через мембрану только в развернутом виде

Шац и др. изучали перенос через мембрану тетраги-дрофолатредуктазы, к которой была искусственно присоединена митохондриальная сигнальная последовательность; без этой последовательности белок не мог проникать в митохондрию. После внедрения в матрикс митохондрии сигнальная последовательность удалялась сигнальной пептидазой. Чтобы выяснить, может ли проходить через мембраны митохондрий белок, находящийся в свернутой конформации, измеряли эффективность транспорта в присутствии метотрексата -- ингибитора, который с высокой избирательностью связывается с нативной формой тетрагидрофолатредуктазы. Обнаружили, что связывание метотрексата приводит к прекращению транспорта, возможно вследствие того, что ингибитор стабилизирует фермент в компактной форме. Было показано также, что для проникновения в митохондриальный матрикс предшественника 0-субъединицы FiFo-АТРазы необходимо его развертывание.

Изучался транспорт в митохондрии укороченных предшественников тетрагидрофолатредухтаэы. Они содержали митохои-дриальную сигнальную последовательность, но трансляция была прервана до завершения синтеза полипептида. Такие укороченные предшественники не связывали метотрексат, а возможно, и ие могли свертываться в конформацию, подобную нативной. Однако они проникали в митохондрии. Особый интерес представлял тот факт, что транспорт укороченных предшественников в отличие от транспорта полноразмерного белка мог осуществляться в отсутствие ATP. Это еще раз подтверждало тот факт, что ATP необходим для разворачивания полипептида. На рис. 10.8 схематически представлена модель процесса переноса белков в митохондрии с указанием стадий, протекающих лишь при наличии трансмембранного потенциала и АТР.

Страницы: 1, 2, 3, 4