тот принцип был продемонстрирован, в частности, при разработке L-цистеиново-го биосенсора с использованием огуречных листьев и аммиачного датчика [45]. В листьях огурца содержится фермент L-цистеиндесульфгидролаза, катализирующий реакциюТаким образом, в цистеиновых сенсорах можно использовать электроды, чувствительные либо к NH3, либо к H2S, хотя из химических соображений первые предпочтительнее. Методика изготовления цистеинового биосенсора довольно проста. Огурцы (Cucumis saturis) выращивают из семени в почве для рассады. По мере необходимости отрываю! зрелые листья и вымачивают их в воде в течение 45 мин. При вымачивании кутикула размягчается и легко удаляется, обнажая биохимически активный эпидермис. Эта процедура необходима, так как субстрат, L-цистеин, с трудом диффундирует через восковый слой кутикулы. Затем из листа вырезают диск нужного размера, помещают его на торец газового датчика и закрепляют диализной мембраной. В фосфатном буферном растворе с рН 7,6 электродная функция такого биосенсора характеризуется наклоном около 35 мВ/рС в диапазоне от 10"3 до 10"5 М. Такой относительно низкий наклон градуировочной кривой, наряду с довольно большим временем отклика, свидетельствует о необходимости дальнейшего совершенствования этого биосенсора. Однако благодаря большому сроку службы сенсоров (до четырех недель) и исключительно низкой стоимости листья и их фрагменты как биокатализаторы вполне могли бы конкурировать с иммобилизованными ферментами и клетками. 2.4 Митохондриальные биосенсорыНаряду с цельными фрагментами тканей млекопитающих в биосенсорах можно эффективно использовать фракции тканевых клеток, иммобилизуя именно те субклеточные компоненты, которые обладают наибольшей биокаталитической активностью. Такой подход может быть весьма плодотворным, если необходимо увеличить количество иммобилизованного фермента или улучшить избирательность сенсора, устраняя мешающие ферменты, которые содержатся в других частях клетки. Показано, что некоторые субклеточные фракции можно использовать как аналитические реагенты. Так. для определения тироксина можно использовать микросомы печени крысы [34]. Первой удачной попыткой создания биосенсора на основе субклеточной фракции был биосенсор для определения глутамина [8]. В этом сенсоре митохондриальную фракцию клеток кортекса почки свиньи иммобилизовали на газоаммиачном датчике. Митохондрии содержат два изофермента глутаминазы [15], активность которых и используют в глутаминовом биосенсоре. Митохондриальную фракцию клеток почки свиньи выделяют по стандартной методике, включающей дифференциальное центрифугирование [26]. Полученную митохондриальную фракцию иммобилизуют с помощью обычной диацетилцеллюлозной диализной мембраны. Собранные биосенсоры помещают в буферный раствор (0,120 М хлорида калия, 0,02 М Трис-хлорида, 0,04 М Трис-фосфата, 0,005 М сукцината, 1 мкг/1,5 мл ротенона, 0,02% азида натрия) с рН 8,5. Сенсоры хранят и используют при комнатной температуре. Аналитические характеристики митохондриального электрода сравнимы с характеристиками тканевых и бактериальных электродов и намного превосходят полученные в системе с выделенным ферментом (табл.3.2). Селективность митохондриального глутаминового биосенсора оказалась очень высокой [8]. Успех в создании митохондриального биосенсора показывает, что субклеточные материалы могут служить эффективными биокатализаторами. Хотя это и не относится к рассмотренному глутаминовому биосенсору, субклеточные фракции можно использовать для улучшения чувствительности и избирательности биосенсора в тех случаях, когда цельные фрагменты тканей не обладают необходимыми свойствами. 2.5 Амперометрические биосенсорыАмперометрическое детектирование находит широкое применение при анализе биологических сред. В оптимальных условиях метод позволяет определять концентрации до 10~8-10~9 М, при этом величина сигнала варьируется в пределах трех-четырех порядков. В связи с биосенсорами имеет смысл рассмотреть основные особенности амперометрии и их влияние на сигнал детектора. Наложение разности потенциалов между электродом сравнения и индикаторным электродом приводит к росту тока, который в свою очередь зависит от концентрации анализируемых электроактивных частиц в растворе. Измеряемый ток может быть непосредственно связан со скоростью электрохимической реакции, протекающей на индикаторном электроде. Важно, однако, найти и научиться контролировать условия, от которых зависит, какая стадия лимитирует скорость всего электрохимического процесса. Скорость гетерогенного переноса электрона (/ст), протекающего непосредственно на электроде, можно контролировать, изменяя приложенный потенциал в соответствии с уравнением Бутлера - Фольмера [10]. Таким образом, во многих системах можно выбрать такое значение потенциала, чтобы ток не лимитировался гетерогенным переносом электрона, даже если этот процесс необратим. При выполнении этого условия скорость определяющей стадией может быть диффузия (массопере-нос), адсорбция или химические реакции. Суммарный ток сенсора описывается следующим выражением: В него входят два диффузионных члена iid и /ed, которые определяются скоростями внутренней и внешней диффузии соответственно. Последний связан с диффузией в объеме раствора вплоть до электрода или границы раздела мембрана/раствор. Внутренняя диффузия включает движение соответствующих частиц в мембране или реакционном слое. Суммарный ток определяется также переносом заряда или адсорбцией реагирующих частиц на мембране или поверхности электрода (; '2d). Перемещение частиц определяемого вещества из раствора к сенсору может сочетаться с химической реакцией, протекающей с конечной скоростью (7к). Следует, однако, подчеркнуть, что члены уравнения (11.1) не являются совершенно независимыми друг от друга. Многие биосенсоры работают при постоянном потенциале, что существенно упрощает приборное оформление. Однако при этом всегда наблюдается фоновый ток, величина которого может быть значимой при низких концентрациях определяемого вещества. Коррекция фонового тока и градуировка биосенсоров in vivo-две серьезные проблемы, которые требуют надежного решения. Колебания этих параметров могут быть обусловлены "отравлением" электрода компонентами среды. Ухудшается также чувствительность и время отклика биосенсора. Если флуктуации базовой линии обусловлены колебаниями концентраций эндогенных электроактивных мешающих частиц, то можно использовать двухэлектродную (дифференциальную) систему. Этот подход использовали при конструировании глюкозного датчика, где один электрод покрыт мембраной на основе глюкозооксидазы, а другой-мембраной, не содержащей фермента. Предполагается, что электроактивные примеси одинаковым образом диффундируют через обе мембраны [60]. В случаях, когда электрод загрязняется примесями из матрицы или продуктом электрохимической реакции, его подвергают многоимпульсной ступенчатой обработке при разных потенциалах [45, 52]. Этот способ позволяет одновременно провести как обработку электрода (в том числе удаление накопившихся на его поверхности пленок), так и установку базовой линии в области потенциалов, в которой отсутствует электролиз. Применяют также различные виды импульсной полярографии, вольтамперометрию (циклическую или с линейной разверткой потенциала). Последняя особенно полезна в двух случаях, описываемых ниже. Многие нейроактивные вещества окисляются при очень близких значениях потенциалов, и поэтому их трудно различить. Полная циклическая вольтамперограмма отражает различие в химических свойствах продуктов электролиза. Она может служить, с одной стороны, для качественного анализа, как "отпечаток пальца" исследуемой системы [56], а с другой-для количественного описания протекающих в ней электрохимических процессов. Недавно было показано [61], что представляющие интерес для биологии органические молекулы могут концентрироваться на обработанной поверхности электрода. При линейной развертке потенциала осадок определяемого вещества удаляется с поверхности, давая четко выраженный пик. Амперометрия является перспективным направлением развития биосенсоров для применения как in vivo, так и in vitro. Широкий динамический диапазон концентраций (104-105) позволяет более широко применять ее на практике, чем потенциометрическое детектирование. Проблема заключается лишь в эффективном сопряжении специфических биохимических реакций с процессами, обуславливающими отклик электрода. Такие сенсоры могут функционировать в исключительно неоднородной среде и (в случае имплантируемых сенсоров) при температуре 37 °С. 3. Возможное использование биосенсоров, применение биосенсоров в клинической медицинеБиосенсор in vivo можно определить как небольшой датчик зондового типа, который вводится либо прикрепляется к телу для непрерывного определения (без добавления реагентов) концентрации веществ, представляющих интерес для выявления патологии или терапии. В литературе многие сенсоры описывают как потенциально имплантируемые, однако, хотя они нередко представляют собой значительные научные достижения, их авторы уделяют мало внимания клиническому подтверждению возможности непрерывного мониторинга концентрации того или иного вещества. Любой in vivo биосенсор (до тех пор, пока они не станут в целом безвредны) представляет риск для пациента или добровольца. Поэтому, выбирая вещество для непрерывного мониторинга, важно установить критерии отбора. По нашему мнению, прежде всего это должно быть вещество, концентрация которого меняется так быстро (как, например, в случае глюкозы в крови или артериального давления кислорода, />аО2), что обычный анализ in vitro не позволяет адекватно следить за ходом этого изменения метода в минуту. Во-вторых, изменения концентрации должны иметь физиологическое или клиническое значение. Общая цель развития in vivo биосенсоров в медицине заключается в том, чтобы улучшить контроль состояния пациентов, и, если исходить из приведенных выше соображений, в настоящее время основными компонентами, для которых имеет смысл непрерывный мониторинг, являются содержащиеся в крови газы, рН, глюкоза и калий. В будущем, возможно, будут разработаны системы с замкнутым контуром, в которых с помощью биосенсоров будут непрерывно контролироваться уровни содержания различных лекарственных веществ в крови, а скорости их поступления из подающего насоса будут регулироваться с помощью обратной связи, что позволит поддерживать их концентрации в узком терапевтическом диапазоне. Значительный интерес представляют и незамкнутые системы для контролируемого введения нескольких лекарственных препаратов [38, 45]. В определенных обстоятельствах имплантируемые биосенсоры могут быть также полезны для периодического аналитического контроля. Теоретически миниатюрные сенсоры должны обеспечивать: доступ в строго ограниченные области в организме; возможность проведения измерений в малых объемах физиологических жидкостей (например, интерстициальной жидкости) без их расходования или удаления; быстрое получение результатов. Можно предположить, что эти достоинства сенсоров можно было бы успешно использовать, например, в ходе хирургической операции, для обнаружения определенных веществ непосредственно в ткани или в сосуде с отсасываемой из нее кровью. Это позволило бы локализовать опухоль, гарантировать правильность удаления и даже установить ее биохимическую природу. 3.1 Газы кровиУ здорового человека парциальные давления кислорода и диоксида углерода в артериальной крови поддерживаются в строго контролируемых пределах (p. dO2 = = 12,6-13,3 кПа; />аСО2 = 4,5-6,1 кПа). Однако при различных нарушениях и болезненных состояниях, прежде всего воздействующих на сердечно-сосудистую и дыхательную систему или регуляцию метаболизма (см. ниже), измерения раО2 и РаСО7, если не принять соответствующих мер по их корректированию, могут приводить к серьезным, а иногда и фатальным клиническим последствиям. Нарушения, сопровождаемые отклонениями от нормы газового состава крови: Дыхательная недостаточность у детейДыхательная недостаточность у взрослыхХроническая закупорка легкихСердечная недостаточностьВрожденные пороки сердцаОперации на сердцеИмеется три категории пациентов, для которых целесообразно ввести непрерывный мониторинг газового состава крови: недоношенные новорожденные, пациенты с острой сердечно-сосудистой или дыхательной недостаточностью (особенно требующие искусственной вентиляции легких) и, наконец, пациенты, подвергающиеся операции на открытом сердце. 3.2 Мониторинг калияКалий имеет первостепенное физиологическое и патологическое значение. Это основной катион, присутствующий внутри клеток. Он играет важную роль в поддержании мембранного потенциала электрически возбудимых клеток, например клеток сердечной мышцы или нервных тканей. В норме концентрация К+ в плазме поддерживается в узком диапазоне (3,8-5,5 ммоль/л), но этот тонкий баланс может нарушаться при многих заболеваниях, в том числе болезнях почек, надпочечников и желудочно-кишечного тракта, сахарном диабете, а также лекарственной терапии (например, при использовании диуретиков). Изменение содержания К+ может существенно влиять на сердечный ритм: гиперкалиемия (наиболее серьезное нарушение, связанное с калием) вызывает брадикардию, фибрилляцию желудочков и, в тяжелых случаях, остановку сердца. Действительно, непрерывный мониторинг К +, очевидно, имеет наибольшую ценность для пациентов, страдающих сердечными заболеваниями (по-видимому, изменения концентрации К+ из-за болезни почек или диабета происходят не так быстро, чтобы обычного анализа in vitro было недостаточно). Рядом исследователей разработаны катетерные калийселективные сенсоры либо на основе обычного потенциометрического ионоселективного электрода с использованием валиномицина в качестве ионофора [55, 58], либо твердотельных приборов типа ионоселективных полевых транзисторов (ИСПТ), покрытых ионоселективной мембраной [34]. Одно из наиболее интересных и полезных приложений К+-сенсоров описано в работе [58]. Два пациента подвергались чрескожной пластической операции транспазушных сосудов сердца с использованием катетерного баллона Грюнзига для расширения коронарной артерии (эта новая методика была разработана, чтобы избежать серьезного хирургического вмешательства при необходимости расширить суженные кровеносные сосуды). Калиевый электрод вводили этим пациентам в коронарный синус (в который поступает кровь, циркулирующая через сердечную мышцу). Было проведено три последовательных раздувания баллонного катетера в течение 20 с с интервалами в 80 с. В ходе ангиопластической окклюзии пациенты не испытывали боли в груди; на электрокардиограммах, регистрируемых на поверхности тела, заметных изменений также не было. При раздувании баллона не наблюдалось изменений концентрации К+ в коронарном синусе, но через 4,5 с после спускания баллона уровень К+ временно повышался на 0,3 ммоль/л выше базовой линии (4,0 ммоль/л). Этот эффект интерпретировали как отмывку от К+ из миокардиальных клеток, происходящую через несколько секунд после ишемии. Если уровень содержания К+ в коронарном синусе действительно может служить для раннего выявления миокардиальной ишемии, то постоянно находящиеся в синусе К+-электроды могут быть полезны при лечении пациентов после острого инфаркта миокарда или хирургической операции на коронарной артерии. 3.3 ГлюкозаОтносительное или полное отсутствие инсулина у больных диабетом приводит к тому, что концентрация глюкозы в крови превышает допустимые в норме узкие пределы (около 3,5-5 моль/л натощак). Около 20% диабетиков, которые в основном заболевают в возрасте около 30 лет, страдают от полного или почти полного разрушения вырабатывающих инсулин клеток поджелудочной железы (островки Лангерганса). Диабет этого типа называют инсулин-зависимым, или диабетом I типа. Для жизни больных диабетом этого типа необходимо восполнение инсулина. Обычно инсулин вводят подкожной инъекцией. И хотя такие инъекции сохраняют жизнь и в значительной степени предотвращают симптомы острой гипергликемии, они все же не могут поддерживать уровень глюкозы в крови на недиабетическом (контрольном) уровне. Иногда содержание глюкозы падает до слишком низких величин (гипогликемия), что сопровождается неприятными проявлениями и опасной потерей сознания; часто, однако, оно столь высоко, что, как всерьез полагают, оказывает весьма существенные и длительные воздействия на ткани в глазах, нервах, почках и кровеносных сосудах. Поэтому в течение последних нескольких лет принимались интенсивные меры к улучшению диабетического контроля. Один из важных подходов в этой области заключается в контролируемом вливании инсулина из портативного насоса "с незамкнутым контуром" [41, 42], что фактически является имитацией секреции инсулина у здоровых людей. Эти приборы могут поддерживать гликемию почти в норме по меньшей мере в течение нескольких лег, однако при самых различных обстоятельствах, например после интенсивной тренировки, в ходе случайной болезни или менструации, есть опасность потери контроля. Логическое развитие этих систем - "замыкание контура" и установление обратной связи, управляющей скоростью вливания инсулина, при помощи имплантируемого глюкозного сенсора. В конечном итоге такая искусственная поджелудочная железа может стать целиком имплантируемой, но это направление находится пока на самой ранней стадии развития, поэтому, прежде чем прогресс станет реальностью, необходимо решить бесчисленное множество технологических, биологических и этических проблем. Между тем имплантируемые глюкозные сенсоры, не связанные с насосами, все еще имеют значительные преимущества, если необходимо дать тревожный сигнал о гипогликемии, предупредить надвигающуюся гипергликемию или кетоацидоз и вообще получать непрерывную информацию о содержании глюкозы в крови, что даст возможность пациенту самому скорректировать и отрегулировать инсулиновую терапию. Возможные применения биосенсоров. Если определить биосенсоры как идеальные приборы, пригодные для имплантации, позволяющие проводить непрерывное наблюдение, уникально чувствительные и свободные от помех, то люминесцентные методы еще должны развиваться и развиваться. Совершенно ясно, однако, что как методы трансляции малых концентраций биологических соединений в легко обрабатываемый сигнал, они заслуживают внимания. Потенциальные возможности этих методов велики, особенно если учесть, что они обладают достаточной чувствительностью и не требуют предварительного разделения пробы. Существующее аппаратурное оформление этих методов в целом является традиционным в том смысле, что подготовленный образец помещают в ячейку или кювету, которую при детектировании излучаемого света ставят перед вакуумным фотоумножителем. Недавние разработки в этой области позволяют предполагать, что в недалеком будущем будет налажен серийный выпуск новых, более удобных приборов. Моделью для многих приборов на основе описанных реакций может служить рассматриваемое ниже устройство, в котором используется оптическое волокно диаметром ~3,3 мм [12]. В этом приборе, измеряющем концентрацию пероксида водорода в буферном растворе, пероксидазу иммобилизуют в прозрачном полиакриламидном геле и вводят люминол как в гель, так и в раствор. С помощью фотоумножителя, помещенного на другом конце волокна длиной 61 см, можно детектировать концентрации до 10~6М. Указывается, что в отличие от других ферментных электродов нет необходимости в том, чтобы продукт ферментативной реакции диффундировал к поверхности электрода. Таким образом, время отклика прибора очень мало, около 4 с. При этом, однако, возникает проблема, связанная с тем, что сигнал лимитируется массопереносом. Использование световода простой формы позволяет сделать конструкцию приборов удобной и работоспособной [4]. Так что эта идея заслуживает внимания. При реализации такого подхода основные проблемы, вероятно, связаны с иммобилизацией фермента. В случае иммуносенсоров, конечно, возникают трудности, обуславливаемые крайне низкой скоростью установления равновесия при связывании лиганда с антителом. Тем не менее благодаря высокой чувствительности детектирования света и независимости от процессов на электроде дальнейшие исследования в этой области представляются перспективными. Развитию аналитических приборов на основе биолюминесценции препятствует трудность получения люциферазы. Однако последние обнадеживающие успехи в этой области, в частности клонирование бактериальной люциферазы [3] и фотопротеина экорина [7], позволяют надеяться, что такой проблемы больше не существует. Теперь можно полагать, что редкость данного организма не будет в дальнейшем сдерживать попытки разработки на его основе новых аналитических методов. Как и в случае любых приборов, основанных на использовании ферментов, возникает вопрос об устойчивости. Уже накоплен довольно большой опыт по использованию люцифераз, иммобилизованных на различных подложках. Препараты люциферазы светляка пока еще недостаточно устойчивы для применения в биосенсорах, однако устойчивость бактериальной люциферазы постоянно улучшается по мере появления лучших методов иммобилизации. Теперь бактериальную люциферазу можно использовать в нескольких сотнях циклов, полагая при этом, что фермент не изменился по сравнению с исходным. Сможет ли на практике этот фермент служить так долго, как немногие известные "долгожители", остается предметом дальнейшего исследования. Еще одна проблема, возникающая при использовании хемилюминесцента и биолюминесценции в сенсорах, связана с необходимостью пополнения реагента. Коль скоро мы хотим использовать такие преимущества эмиссии света, как простота детектирования и высокая чувствительность, то в конструкции прибора необходимо предусмотреть и возможность добавления реагента. Следует понимать, что рассматриваемое явление предполагает необратимое окисление субстрата-люциферина в случае биолюминесценции и легко доступной небольшой органической молекулы в хемилюминесценции. Для многих описанных в этой главе реакций удается сделать так, чтобы их скорость зависела только от концентрации определяемого вещества. В настоящее время единственный способ достижения этого состоит во введении избытка люминесцирующего соединения. В обычном анализе такое "буферирование" самим реагентом не представляет проблемы, но нужно проявить немало изобретательности, чтобы добиться того же эффекта в пределах ограниченного рабочего объема сенсора. Если, однако, допустить, что концентрация определяемого вещества не слишком отличается от нижней границы диапазона определяемых концентраций (это предположение вполне согласуется с исключительной чувствительностью метода), то нетрудно найти приемлемую конструкцию прибора. Интересным примером долговременного обеспечения природной люминесцентной системы люциферином является сам светляк. Этот организм появляется из куколки со всем запасом люциферина, который необходим на время (около одного месяца) почти непрекращающегося импульсного свечения по ночам! Учитывая, что потребность фотоумножителей в фотонах существенно ниже интенсивности вспышки светляка, можно было бы оценить продолжительность работы сенсора. До такой оценки нельзя дать точный ответ на этот вопрос, однако в лучших случаях продолжительность работы сенсора не слишком отличается от срока службы ферментов, используемых в существующих биосенсорах. Хемилюминесцирующие соединения могут функционировать в виде твердых тел или паст; можно предусмотреть и удерживающие их полупроницаемые мембраны в сочетании с соответствующим образом измененными соединениями. ЗАКЛЮЧЕНИЕКоммерческому будущему биосенсоров, предсказываемому многими, может угрожать целый ряд непредвиденных осложнений, в том числе плохие отзывы о товаре, усиленная конкуренция, отсутствие потребности, технические трудности, законодательные или патентные проблемы, плохой маркетинг или сбыт, плохой дизайн товара. Путь к коммерческому успеху биосенсора лежит через анализ рынка, глубокое понимание потенциальных преимуществ, финансовую поддержку, всеобъемлющий маркетинг и сбыт, целеустремленность. При условии удачных коммерческих решений потенциал этих приборов действительно очень велик. Однако коммерческое продвижение биосенсоров - это область приложения сил не для тех, кто согласен со старым изречением Кромвеля о том, что идущий дальше всех не знает, куда ведет дорогаВ последние годы биосенсоры привлекают значительное внимание как достойные преемники целого ряда аналитических методов контроля, использовавшихся в клинических лабораториях, ветеринарии и пищевой промышленности. Действительно, потенциальные приложения сенсорной техники столь широки, что можно лишь отметить некоторые наиболее важные тенденции, проявившиеся при распространении и сбыте этих приборов за последние несколько лет. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биосенсоры: основы и применения / Под ред. Д. Тернера. М.: Мир, 1992.
2. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3 т. / Под ред. Р. Сопера. М.: Мир, 1996.
3. Евдокимов Ю.М. Биосенсоры на основе одноцепочечных и двухцепочечных нуклеиновых кислот // Сенсорные системы. 1998. Т.12. Вып.1. С.5-21.
4. Решетилов А.Н. Модели биосенсоров на основе потенциометрических и амперометрических преобразователей для использования в медицине, биотехнологии, мониторинге объектов окружающей среды (обзор) //
5. Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т.32. № 11. С.78-93.
6. Сафронова О.Г., Химченко В.И., Штарк М.Б. Тканевые и клеточные биосенсоры. Возможности клинического применения (обзор) // Медицинская техника. 1995. № 6. С.39-46
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
