Постсинаптическая трансформация сигнала

В прекращении сигнала цАМФ участвуют фосфодиэстераза, гидролизующая этот нуклеотид до АМФ. В противоположность аденилатциклазе фосфодиэстераза - преимущественно растворимый фермент. В то же время активность фермента обнаружена во фракциях саркоплазматического ретикулума, митохондрий и ядер.

Циклонуклеотидактивируемая фосфодиэстераза гидролизует как цАМФ, так и цГМФ, при этом под действием цГМФ ускоряется гидролиз цАМФ и наоборот, что свидетельствует о положительной кооперативности двух активных центров. Несомненна роль фермента в проведении нервного импульса: так, в постсинаптической мембране нервной ткани обнаружен необычайно высокий уровень фосфодиэстеразы цГМФ.

Для фосфодиэстеразы характерно наличие множественных форм. Эти формы различаются как по молекулярной массе, так и по сродству к одному и тому же и к различным циклическим нуклеотидам. В целом, сродство к циклическим нуклеотидам у фосфодиэстераз в 100-1000 раз ниже, чем у протеинкиназ А и G, поэтому при ускорении синтеза нуклеотидов сначала происходит насыщение циклическими нуклеотидами регуляторных центров киназ и лишь затем - гидролиз цАМФ и цГМФ фосфодиэстеразами.

В мозге содержатся Са-кальмодулинрегулируемые формы как цАМФ-синтезирующего, так и цАМФ-гидролизующего ферментов. Са-кальмодулинзависимая фосфодиэстераза представляет собой гомодимер, состоящий из субъединиц с различной молекулярной массой у разных изоформ фермента. Ограниченный протеолиз субъединицы 60 кД приводит к появлению фрагмента с Мг = 36 кД и необратимой активации фосфодиэстеразы. Фрагмент 36 кД более не активируется кальмодулином. Следовательно, субъединицы фосфодиэстеразы включают 2 фрагмента: каталитический и регуляторный.

Анализ регуляторных свойств фосфодиэстеразы в нервной ткани свидетельствует о тесном сопряжении между цАМФ- и Са-зависимыми системами внутриклеточной сигнализации; это сопряжение может модулироваться с помощью изоферментов фосфодиэстеразы. Так, в мозге быка найдены 2 изоформы Са-КМ-зависимой фосфодиэстеразы, состоящей из субъединиц с Мг = 60 и 63 кД. Изофермент с субъединицами 60 кД может быть фосфорилирован цАМФ-зависимой протеинкиназой, что приводит к уменьшению сродства фосфодиэстеразы к кальмодулину. Дефосфорилирование этого изофермента осуществляет Са-КМ-стимулируемая протеинфосфатаза; при этом восстанавливается чувствительность фосфодиэстеразы к кальмодулину.

В отличие от изофермента с субъединицами 60 кД фосфорилирование изоформы фосфодиэстеразы с субъединицами 63 кД осуществляется Са-КМ-зависимыми протеинкиназами. Это фосфорилирование также приводит к потере чувствительности фосфодиэстеразы к кальмодулину и "обращается" Са-КМ-стимулируемой протеинфосфатазой с восстановлением чувствительности фосфодиэстеразы к КМ. Очевидно, такой механизм регуляции фосфодиэстеразы реализуется в мозге in vivo, несмотря на очень высокую, "насыщающую" концентрацию в нем КМ. Фосфорирование снижает сродство фермента к КМ и обусловливает зависимость его активности от физиологических концентраций Са+.

В нервной ткани, таким образом, существует тесная взаимосвязь между двумя системами вторичных посредников, Са+ и цАМФ, осуществляемая посредством цАМФ- и Са-зависимого фосфорилирования-дефосфорилирования различных изоферментов фосфодиэстеразы цАМФ. Эта взаимосвязь может модулироваться также различным сродством к Са+ аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, протеинкиназы и фосфатазы. Так, аденилатциклаза мозга активируется гораздо более низкими концентрациями Са чем фосфодиэстераза.

Кроме циклических нуклеотидов, Са+ и ограниченного протеолиза фосфодиэстеразу активируют также полианионы, фосфолипиды, жирные кислоты. Ингибиторами или активаторами фермента являются многочисленные фармакологические вещества. Фосфодиэстераза является более "удобной" мишенью для действия лекарственных препаратов, чем аденилатциклаза, так как менее специфична в отношении эффекторных влияний. Мощными ингибиторами фосфодиэстеразы являются производные ксантинов - ингибирование осуществляется блокадой аллостерического центра связывание нуклеотидов.

2. цГМФ-зависимое протеинфосфорилирование

Вскоре после открытия цАМФ-зависимых протенкиназ был обнаружен еще один класс циклонуклеотидзависимых фосфорилирующих ферментов, стимулируемых с помощью цГМФ, - протеинкиназы G. В тканях млекопитающих содержание протеинкиназ G весьма невелико. Наиболее высок уровень активности и содержания протеинкиназ G в мозжечке, сердечной мышце и легких, эти же ткани содержат и наибольшее количество цГМФ, не превышающее, впрочем, 10% от содержания в них цАМФ. Основное количество протеинкиназы G обнаружено в цитозоле, некоторая часть фермента связана с цитоплазматическими мембранами и ядерной фракцией.

Фермент состоит из двух примерно идентичных субъединиц, каждая из которых имеет каталитическую активность и способна связывать циклический нуклеотид. Ограниченным протеолизом можно перевести димер в мономеры и затем разделить каждую субъединицу на цГМФ-связывающий и каталитический фрагменты. Эти исследования наряду с выявленной гомологией между протеинкиназой G и протеинкиназой А II типа по субстратной специфичности, аминокислотной последовательности, способности к аутофосфорилированию, иммунологическим свойствам привели к представлению о том, что цАМФ и цГМФ-зависимые протеинкиназы эволюционировали от общего гена, кодирующего одну полипептидную цепь. В процессе развития цАМФ-зависимый фермент стал синтезироваться в виде разобщенных компонентов, тогда как цГМФ-зависимая протеинкиназа синтезируется как одна цепь.

В отличие от каталитической субъединицы протеинкиназы А, способной высвобождаться во время активации фермента, внутриклеточное перемещение "недиссоциированной" протеинкиназы G может быть затруднен. На основании аминокислотного анализа протеинкиназы G было установлено, что одна субъединица фермента содержит два центра связывания нуклеотида.

Регуляторная N-концевая половина молекулы протеинкиназы G сходна с семейством цАМФ-связывающих белков, в то время как каталитическая Сконцевая половина родственна группе киназ с различной специфичностью. Протеинкиназа G способна к аутофосфорилированию из расчета 2 моля фосфата на 1 моль холофермента. Аутофосфорилирование не изменяет сродства к цГМФ и незначительно повышает Vmakc фосфотрансферазной реакции, но заметно увеличивает сродство протеинкиназы G к цАМФ. Таким образом, аутофосфорилирование может обусловливать регуляцию протеинкиназы G не только с помощью цГМФ, но и цАМФ.

Протеинкиназа G фосфорилирует, вероятно, те же аминокислотные остатки в молекуле субстрата, что и протеинкиназа А, но с гораздо меньшей скоростью. Различная скорость фосфорилирования протеинкиназ А и G может являться основой их субстратной специфичности.

Как упоминалось, наибольшее содержание протеинкиназы G в нервной ткани отмечено в мозжечке. В свою очередь, в этом отделе мозга фермент локализован в клетках Пуркинье. Найдена корреляция между увеличением содержания G-киназ в цитоплазме клеток Пуркинье, началом роста дендритов и установлением синаптических контактов в клетках Пуркинье и подобных им субкортикальных клетках, что может свидетельствовать в пользу безусловной значимости цГМФ-зависимого фосфорилирования для нейрональной дифференцировки этих клеток. В клетках Пуркинье находится и единственный в мозге млекопитающих специфичный субстрат для протеинкиназы G, названный G-субстратом; G-субстрат - кислоторастворимый и термостабильный белок с Мг = 23 кД. Обнаружено, что фосфорилированный с помощью цГМФ-зависимой протеинкиназы G-субстрат ингибирует протеинфосфатазу, выделенную из мозжечка, являясь специфичным для клеток Пуркинье протеинфосфатазным ингибитором. При этом ингибируемая фосфатаза из этих клеток, вероятно, катализирует дефосфорилирование белков, не являющихся субстратами протеинкиназы А.

Увеличение уровня цГМФ обусловлено взаимодействием с плазмалеммой различных гормонов и нейромедиаторов. Так активируется связанная с мускариновыми рецепторами гуанилатциклаза Активация гуанилатциклазы обычно обусловлена мобилизацией Са+ из эндоплазматического ретикулума.

В клетках мозга обнаружен термостабильный белок, стимулирующий активность протеинкиназы G, но не изменяющий активность протеинкиназы А. Обратный процесс - инактивация протеинкиназы G состоит в гидролизе цГМФ фосфодиэстеразой, специфичной для этого нуклеотида. Кроме того, в тканях млекопитающих, в том числе и нервной, найден ингибитор G-киназы с Мг = 15 кД.

Отметим, что системы циклических нуклеотидов осуществляют внутриклеточную регуляцию в тесном взаимодействии друг с другом. Так, например, если концентрация цАМФ в клетке длительное время повышена, может происходить фосфорилирование белков, встроенных в каналы плазматической мембраны, что приводит к повышению в цитоплазме концентрации Са+. В результате этого активируются фосфодиэстераза и гуанилатциклаза; соответственно ускоряется гидролиз цАМФ и образуется цГМФ.

Итак, цГМФ играет важную роль в нервной системе, особенно в клетках Пуркинье мозжечка. Об этом свидетельствует избирательная локализация в этих клетках всех компонентов системы цГМФ, включая гуанилатциклазу, протеинкиназу G и G-субстрат. Различные нейромедиаторы, в том числе ацетилхолин, вызывают увеличение уровня цГМФ в клетках Пуркинье и активацию G-киназы, что, по всей видимости, модулирует такие свойства этих клеток, как скорость проведения возбуждения и способность к стимуляции.

Установлено также, что цГМФ модулирует активность ионных каналов мембран нервных клеток. Так, введение в нейроны улитки цГМФ или G-киназы увеличивает проводимость Са-каналов.

3. Са-кальмодулинзависимое протеинфосфорилирование

Как упоминалось, в процессе эволюции выработались эффективные механизмы удаления Са+ во внеклеточное пространство или специализированные внутриклеточные структуры. Низкая внутриклеточная концентрация Са+ позволила клеткам использовать "впрыскивание" Са+ в цитоплазму как сигнал на внешние воздействия. При этом кальций может быть даже более универсальным внутриклеточным регулятором, чем цЛМФ. Так, период действия Са+ очень короток и измеряется миллисекундами, а не секундами, как в случае цАМФ. Как стало понятно в последнее время, обе системы вторичных посредников функционируют в тесном взаимодействии.

Для внутриклеточной "реализации" кальциевого сигнала в процессе эволюции созданы специальные внутриклеточные белковые рецепторы Са+, способные опосредовать действие этого иона на молекулярные мишени. Основным рецептором Са+ во всех клетках является кальмодулин. Кальмодулин - глобулярный белок сМг - 16,5 кД. Структурно он очень консервативен: так, обнаружено только шесть или немногим более аминокислотных замен в кальмодулине, выделенном из живых объектов, эволюционно разделенных миллионами лет. Кальмодулин содержит 4 Са-связывающих участка: в состав каждого из этих участков входят кислые остатки аминокислот, необходимые для связывания Са+ и обусловливающие низкое значение изоэлектрической точки KM. Фосфорилированных форм КМ не обнаружено.

Кальмодулин локализован главным образом в цитоплазме, а также ассоциирован с различными клеточными структурами, микротрубочками и мембранами, включая постсинаптические мембраны. Внутриклеточное распределение КМ регулируется циклическими нуклеотидами. Так, цАМФ-зависимый транспорт Са+ через клеточные мембраны может изменять сродство КМ к мембранной и цитоплазматической фракциям клетки.

При стимулировании происходит связывание Са+ с КМ. В результате кальмодулин претерпевает конформационные изменения: экспонирование гидрофобного участка при этом - важное условие для последующего взаимодействия КМ с акцепторными белками. Среди ферментов-исполнителей, активность которых модулируется в присутствии КМ, непосредственное отношение к регуляторным реакциям внутриклеточного протеинфосфорилирования имеют Са-КМ-зависимые протеинкиназы, аденилатциклаза, фосфодиэстераза циклических нуклеотидов и КМ-зависимая протеинфосфатаза.

На первый взгляд, способность КМ во многих тканях активировать системы как синтеза, так и деградации цАМФ выглядит парадоксом. Однако локализация ферментов аденилатциклазы в мембране, а фосфодиэстеразы в интозоле обусловливает преимущественную Са-активацию аденилатциклазы. Кроме того, для полной активации аденилатциклазы достаточно комплекса КМ-Са+, а для фосфодиэстеразы необходимо заполнение третьего, а возможно, и четвертого Са-связывающего участка КМ. Это означает, что аденилатциклаза активируется при более низких концентрациях Са+.

Результатом действия Са+ и кальмодулина часто является фосфорилирование, катализируемое Са-КМ-зависимыми протеинкиназами. К настоящему времени обнаружено 3 тина КМ-зависимых протеинкиназ В, которые в порядке убывания молекулярной массы обозначаются как протеинкиназы В I, II и III. Основные различия этих типов протеинкиназы В относятся к их субстратной специфичности. Так, протеинкиназа В I типа фос-форилирует лишь несколько белков в нервной ткани, в то же время для киназы II типа только в головном мозге найдено более 10 субстратов. Сродство этих протеинкиназ к КМ практически одинаково, что свидетельствует об одинаковой структуре КМ-узнающего участка фермента.

В нервной ткани, где концентрация Са-КМ-зависимых протеинкиназ особенно высока, обнаружены специфические изоферменты В-киназ I и II типа. Так, в мозге быка найдено, по меньшей мере, 3 изофермента В-киназы I типа. Высокомолекулярные олигомерные В Н-киназы из лобных долей мозга и мозжечка отличаются по субъединичному составу. Если первый фермент состоит из субъединиц а и р с Мг = 50/55 и 60/65 кД в молярном соотношении 3:1, то В-киназа из мозжечка имеет другое соотношение этих субъединиц - 1:4. Гетерогенность и высокая концентрация В-киназ в нервной ткани может обусловливать физиологическую значимость Са-КМ-зависимого фосфорилирования в клетках нервной системы.

Как установлено, протеинкиназа В II типа составляет примерно 0,4% от общего белка головного мозга млекопитающих, что свидетельствует о важной регуляторной роли фермента в этом отделе ЦНС. В-киназа II типа преимущественно связана с мембранной фракцией в отличие от "цитоплазматической" киназы В I типа. Мембраносвязанный фермент II типа сконцентрирован в области постсинаптического уплотнения в тех отделах нервной системы, которые связаны с обучением. Киназа В II типа обладает свойствами двухфазного переключателя со стабильностью, необходимой для кодирования долговременной памяти.

КМ-зависимые протеинкиназы могут быть разделены на 2 группы по структурным особенностям. Так, в одной группе КМ является интегральной частью фермента, а в другой - способен обратимо диссоциировать от протеинкиназы. Примером первого случая может служить киназа фосфорилазы, [Три активации фермента Са+ связывается с субъединицей фермента, являющейся кальмодулином. Около 20 лет назад было обнаружено стимулирующее действие на киназу фосфорилазы протеинкиназы А. К настоящему времени установлено, что 10-20 кратное увеличение активности фермента может быть вызвано цГМФ-зависимой и КМ-зависимой протеинкиназами. Участие экзогенного КМ в регуляции активности киназы фосфорилазы происходит только при отсутствии стимулов, приводящих к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ. Гликоген и ферменты его метаболизма присутствуют в глии и нейронах: электростимулируемое расщепление гликогена в нервной ткани регулируется посредством активации киназы фосфорилазы.

Киназа легких цепей миозина является представителем второй группы КМ-зависимых протеинкиназ. Регуляция с помощью КМ-киназы легких цепей миозина осуществляется по принципу "все или ничего". Так, в отсутствие КМ фермент практически не активен, а при действии комплекса Са-КМ его активность возрастает в 200-300 раз. Установлено, что АТФазная активность актомиозина мозга увеличивается в 2-3 раза при фосформировании миозина киназой легких цепей.

Как упоминалось, активность КМ-зависимых протеинкиназ модулируется аутофосфорилированием. Аутофосфорилирование 2 субъединиц киназы фосфорилазы приводит к значительному увеличению ее активности. Аутофосфорилирование регулирует также компартментализацию В-киназ в нервных клетках, как это показано на нейронах аплизии. В присутствии комплекса Са-кальмодулин или цАМФ происходит транслокация активности В-киназы в цитозоль из мембраноцитоскелетной фракции. В-киназа тесно ассоциирована с определенными белками цитоскелета и мембран: фосфорилирование этих белков, как показано на препаратах мозга крыс, приводит к ослаблению сродства В-киназ к мембранам и цитоскелету.

Очевидно, что изменения в содержании цитоплазматического Са+ имеют множественные последствия для синаптической функции, особенно для экзоцитоза. Мишенью ряда регулирующих экзоцитоз лекарственных препаратов и антител может быть кальмодулин. Установлено, что запускаемая деполяризацией секреция вазопрессина и окситоцина из нервных терминалей гипофиза является Са-зависимой и не требует участия цАМФ или протеинкиназы С, причем комплекс Са - кальмодулин связывается с белками мембран секреторных гранул, представляющими собой, вероятно, субъединицы специфичной протеинкиназы. Следствием этого процесса является усиление экзоцитоза посредством слияния мембран секреторных гранул с цитоплазматической мембраной.

В секреции нейромедиаторов принимают участие протеинкиназы В I и II типа, а также протеинкиназы А и С. Взаимодействие этих протеинкиназ отчетливо проявляется при фосфорилировании синапсинов - специфических белков синаптических структур. Один из этих белков - синапсин I, составляющий 6% от общего белка высокоочищенных синаптических везикул и являющийся своеобразным "мостиком" между везикулами и цитоскелетом, фосфорилируется протеинкиназой В I типа и протеинкиназой А по одному остатку серина. Два других остатка серина в молекуле синапсина I фосфорилирует протеинкиназа В II типа и, вероятно, протеинкиназа С. В нейронах найден так называемый протеин-Ш - белок, также связанный с синаптическими мембранами и по ряду свойств напоминающий синапсин I. Протеин-Ш по единственному остатку серина фосфорилируют как протеинкиназа А, так и протеинкиназа В I типа. Очевидно, цАМФ- и Са-зависимое фосфорилирование синапсина I и протеина-III обеспечивает регуляцию секреции нейромедиаторов. Так, инъекция в синапс В-киназы II типа увеличивает секрецию, в то время как инъекция дефосфорилированного синапсина I угнетает высвобождение нейромедиаторов. Для эффективной секреции необходимо одновременное фюсфорилирование синапсина I А-, В- и С-киназами. Секреция нейромедиаторов регулируется, по-видимому, разрывом связи фосфорилированного синапсина I с актином и тубулином. В результате везикулы высвобождаются из комплекса с белками цитоскелета и становится возможной Са-индукция экзоцитоза. Предполагается также, что сконцентрированные в синаптических окончаниях молекулы В-киназы II типа сами по себе являются стерическим препятствием для высвобождения медиаторов из секреторных везикул. Аутофосфорилирование киназы способствует ее диссоциации на субъединицы и, таким образом, стимулирует секрецию.

Важную роль в функционировании нейронов играет совместное фосфорилирование протеинкиназами А II типа и В II типа высокомолекулярного белка МАР-2, сконцентрированного в дендритах нейронов. Как упоминалось, именно здесь локализована Р-субъединица А-киназы II типа, которая обладает высоким сродством к МАР-2 и является своеобразным "якорем" цАМФ-зависимой фосфорилирующей активности в дендритах. МАР-2 участвует в сборке микротрубочек: фосфорилирование этого белка киназами В и АII типа контролирует процесс сборки и, таким образом, может модулировать функциональную активность нейронов. МАР-2 фосфорилирует также протеинкиназа С; роль этого процесса в функционировании нейронов выясняется.

Предполагается, что комплекс МАР-2 - Р-субъединица А-киназы II типа может изменять проницаемость мембран нейронов для Na+ и К+ без фосфорилирования К-субъединицей киназы. Возможно, сигналом для такого изменения мембранной проницаемости является взаимодействие цАМФ с Р-субъединицей протеинкиназы II типа, ассоциированной с МАР-2. Сигнал распространяется по цитоскелету к мембране нейронов с очень высокой частотой; для поддержания такой частоты достаточное время требуется энергия АТФ.

Синергизм в действии протеинкиназ В и А в нервной ткани проявляется также при потенцировании цАМФ-индуцируемых входящих токов внутриклеточными ионами Са. Повышение внутриклеточной концентрации цАМФ в нейронах виноградной улитки приводит к деполяризации мембраны, а в условиях фиксации потенциала - к возникновению ионного тока по каналам пассивной проницаемости. Увеличение внутриклеточной концентрации Са+ приводит к значительному увеличению амплитуды и длительности цАМФ-тока.

Можно полагать, что синергическое действие Са+ и иАМФ на соответствующие ионные каналы связано с наличием у последних двух различных участков фосфорилирования; для В- и А-киназ. Возникающие под влиянием КМ-зависимого фосфорилирования изменения в структуре канала обеспечивают повышение доступности соответствующего участка фосфорилирования для протеинкиназы А. Напротив, при изучении влияния внутриклеточного Са+ на Са-зависимые калиевые каналы взаимодействие двух систем вторичных посредников отличается тем, что цАМФ выступает в роли агента, повышающего чувствительность канала к внутриклеточному Са+ и КМ. Можно полагать, что регуляция числа каналов и их активности с помощью протеинфосфорилирования связана с изменениями в процессах поведения и обучения.

В последнее время появились данные о регуляции протеинкиназной и протеинфосфатазной активности с помощью Са-связывающего белка S-100. S-100 активирует фосфопротеинфосфатазы мозга, а также модулирует активность ядерных и цитоплазматических протеинкиназ этой ткани, в частности К-субъединицы протеинкиназы A. S-100 ингибирует фосфорилирование ряда субстратов в клетках мозга; кальмодулин активирует фосфорилирование этих же белков. Возможно, S-100 и кальмодулин действуют в мозге как антагонисты. Во всяком случае, в нервной ткани реализуется еще один путь Са-зависимого фосфорилирования-дефосфорилирования, независимый от КМ-стимулируемого процесса. S-100-стимулируемое фосфорилирование-дефосфорилирование может принимать участие в регуляции ряда функций нервных клеток.

Необходимо отметить участие В-киназы II типа наряду с протеинкиназой А в фосфорилировании и соответствующей активации т! фозингидроксилазы, что приводит к ускорению синтеза катехоламинов в ответ на нервный импульс и нейромедиаторный сигнал. Установлено, что тршггофангидроксилаза - фермент, катализирующий первую реакцию биосинтеза серотонина, также фосфорилируется протеинкиназой В II типа. Фосфорилирование триптофангидроксилазы приводит к двукратному увеличению ее активности. Таким образом, Са-КМ-зависимое фосфорилирование ферментов, принимающих участие в синтезе нейромедиаторов и гормонов, является одним из ключевых аспектов участия В-киназ в нейрогуморальной регуляции.

Отметим, что на основании результатов многочисленных исследований установлена тесная взаимосвязь между процессами, регулируемыми Са+, цАМФ и 2-5А. Это дает основание для их рассмотрения в рамках единой регуляторной системы. Взаимодействие Са+, цАМФ и 2-5А обусловлено двумя типами регуляторных связей. Во-первых, ряд жизненно важных для клеток реакций контролируется этими вторичными посредниками одновременно. Так, например, активность киназы фосфорилазы гликогена зависит от цАМФ и Са+, скорость синтеза белка полирибосомами контролируется с помощью фосфорилирования А-киназой и уровнем 2-5А и т.д. Во-вторых, увеличение внутриклеточного уровня одного из посредников приводит к изменению содержания других. Так, возрастание уровня пАМФ обусловливает индукцию олигосинтетазы и ингибирование 2'-фосфодиэстеразы, что приводит к увеличению концентрации 2-5А. В свою очередь, Са* и 2-5А активируют фосфодиэстеразу цАМФ и тем самым вызывают падение уровня цАМФ. Кроме того, увеличение внутриклеточного уровня цАМФ приводит к выбросу Са+ из митохондрий в цитоплазму и высвобождению кальмодулина из примембранных компартментов.

4. Са+-фосфолипид-зависимое протеинфосфорилирование

Страницы: 1, 2, 3