Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом
b>В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют.1.4 Микробиологический и биохимический контроль производстваНезависимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведется контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивироваиня устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. С целью выявления возможных заражений производится периодический высев проб на агаризорованные среды с введением факторов, подавляющих рост продуцента. Постоянно ведется определение накопления в культуре ферментативной активности. При глубинном культивировании ведут контроль за потреблением основных лимитирующих компонентов среды (углеводы, N, Р), измеряют рН культуры.Все показатели роста культуры, изменения состава среды и накопления ферментов и т. д. заносятся в лабораторный журнал.На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают особенно тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсеменённости микрофлорой определяется в каждом конкретном случае. Например, в грибных препаратах из поверхностных культур она не должна превышать 1·105 клеток на 1 г препарата. При контроле готовых препаратов на обсеменённость микроорганизмами делают высевы проб от каждой партии на твердые среды (МПА и сусло-агар) в чашки Петри. Заражение выражается количеством микроорганизмов на 1 г препарата. Контроль на зараженность спороносными бактериями проводится путем высева нагретых до 80 °С проб на чашах Петри с агаризорованной средой. Культивирование для выявления бактериального заражения ведут при 37 °С в течение 24 ч, а для грибного - при 30 °С в течение 48 - 72 ч.В готовых препаратах определяют влажность и активность в стандартных единицах на 1 г препарата.Технические жидкие и сухие ферментные препараты анализируют на активность ферментов, содержание сухого вещества и в зависимости от назначения на наличие микробного загрязнения. При контроле высокоочищенных препаратов помимо определения загрязненности микробами и активности ферментов проводятся анализы на содержание белка, зольных элементов, углеводов и других специфических свойств ферментов.Кроме того, любой ферментный препарат перед промышленным производством подвергают длительной проверке в специальных медицинских учреждениях на токсичность, особенно если препарат предназначен для пищевой и медицинской промышленности. Токсичность препарата зависит от способности микроорганизма синтезировать в процессе жизнедеятельности токсины или канцерогенные вещества, а также от состава используемой для культивирования среды и способов выделения фермента. Исследования на токсичность проводят на лабораторных животных, которым вводят внутримышечно и перорально ферментные препараты в различном виде и дозировке и наблюдают реакцию организма.Только после тщательного биологического исследования при положительных результатах дается разрешение на промышленное производство препарата и на его применение в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве и других областях.1.5 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препаратыИнженерные мероприятия являются наиболее важными. Они призваны максимально предотвратить выход и вынос ферментных препаратов в помещения и за пределы предприятия, т. е. исключить контакт с ними человека. Известно также, что в производстве помимо самих ферментных препаратов используется ряд веществ, обладающих токсическими свойствами. Попадая в организм человека, такие вещества могут вызвать отравления и даже профессиональные заболевания.Степень воздействия различных веществ на организм зависит от дисперсности раздражителя, его концентрации, продолжительности воздействия и путей проникновения в организм. Основными путями проникновения токсических веществ в организм являются органы дыхания (при загрязнении воздуха производственных помещений микроорганизмами - продуцентами, парами, пылью ядовитых веществ и аллергентов), пищеварительный тракт (при приеме пищи в цехе, недостаточно тщательном мытье рук перед едой), а также кожа (при загрязнении ее токсическими веществами и спорами продуцента). На предприятиях, выпускающих ферментные препараты, при использовании поверхностного способа культивирования продуцентов определенную опасность для окружающих представляет воздух заводских помещений, если он загрязнен органической пылью, содержащей отдельные компоненты питательных сред (мелкие частицы отрубей, ростков, опилок и др.), полупродукты производства (культура продуцента), готовую продукцию (мельчайшие частицы порошкообразных препаратов) и, главное, споры и конидии микроорганизмов - продуцентов ферментов. Наиболее тяжелые условия для работающих в цехе хранения и транспортирования сыпучих компонентов сред, приготовления питательных смесей и в цехах, связанных с приготовлением спорового посевного материала, транспортированием и дроблением готовой культуры, а также в производственных помещениях, где проводятся измельчение высушенных осадков ферментов и наполнителей, их смешивание и фасование готовых препаратов. При отсутствии на предприятии специальных герметизирующих устройств в местах пыления и при нарушении нормальной работы приточно-вытяжной вентиляции во всех помещениях содержание органической пыли повышается до 80 - 125 мг/м3, что отрицательно действует на здоровье работающих и может привести даже при более низких концентрациях органической пыли в воздухе к воспламенению и взрыву.Наибольшая опасность для персонала при поверхностном способе культивирования микроорганизмов - это непосредственный контакт с культурой продуцента. Должна быть точная гарантия в том, что данный микроорганизм не патогенен и что он тщательно обследован перед передачей на производство. При работе с микроорганизмами используются индивидуальные средства защиты, не допускается вход в растильную камеру во время роста культуры, особенно на стадии спорообразования и подсушивания культуры. Отбор проб культуры должен проводиться пробоотборниками, исключающими возможность попадания культуры на кожу работающего. Нарушение правил работы, отсутствие аспирационных и герметизирующих устройств могут способствовать увеличению запыленности воздуха, а при работе с готовой культурой - повышению концентрации спор микроскопических грибов в воздухе до 104 - 105 на 1 м3, что может повлечь за собой заболевание работающих. Наиболее часто отмечаются поражения кожи и слизистых - контактный аллергический дерматит. Часто при прекращении контакта с аллергентом явления дерматита исчезают, но у некоторых лиц наблюдается явление сенсибилизации и при возобновлении работы вновь появляются признаки дерматита.Основными мерами профилактики в производстве ферментных препаратов являются: максимальная герметизация оборудования и механизация процессов; применение индивидуальных средств защиты (комбинезоны, шлемы-капюшоны, халаты, перчатки, косынки, респираторы); ежедневный теплый душ после работы, обеспыливание, стерилизация рабочей одежды; мытье рук и полоскание рта перед приемом пищи; ежегодные медицинские осмотры; прием во время работы молочного колибактерина или молока. К работе на предприятиях ферментной промышленности нельзя допускать лиц с заболеваниями почек, печени, желудочно-кишечного тракта, легких, а также склонных к кожным болезням.Уменьшение запыленности заводских помещений достигается путем герметизации оборудования. Если это невозможно по местным условиям, то устанавливают устройства с индивидуальной аспирацией данного узла. Операции, связанные с пылевыделением, необходимо изолировать от других помещений, по возможности механизировать и автоматизировать.При глубинном культивировании продуцентов ферментов опасность поражения работающих спорами продуцента уменьшается, сокращается число технологических участков, являющихся источником пыли. Тщательного контроля в производствах с этим видом культивирования требуют цех приготовления питательных сред, операции по транспортированию и хранению сыпучих компонентов среды, а также цех получения и измельчения ферментных препаратов.Особенно большое внимание уделяется на предприятиях, выпускающих ферментные препараты и другие продукты микробного синтеза, вопросам очистки воздуха, используемого для аэрирования растущей культуры перед его выбросом в атмосферу. Повышенная обсеменённость отходящего воздуха может вызвать накопление в атмосфере, прилежащей к заводу, микроорганизмов-продуцентов, что недопустимо. Поэтому весь отходящий воздух должен тщательно очищаться и контролироваться на количество микроорганизмов и их видовой состав. Удаляемый из помещений воздух, загрязненный микроорганизмами, очищают на масляных и обеспложивающих фильтрах типа ФТО-1000 или ФТО-750. Если воздух просто запылен, его очищают на обычных масляных фильтрах, циклонах и рукавных фильтрах.Нормальные условия для работающих на предприятиях ферментной промышленности поддерживаются с помощью приточно-вытяжной вентиляции, обеспечивающей 4 - 8-кратный воздухообмен в вентилируемом помещении. Воздух, подаваемый в рабочие помещения, за исключением специальных помещений (с растительными камерами для поверхностного культивирования), должен иметь относительную влажность около 60 - 65 % и температуру 18 - 20 °С. Он должен быть полностью очищен от пыли, а для некоторых цехов - и от микроорганизмов. При использовании мокрой уборки полов рекомендуется для обеспечения нормальных условий делать полы с небольшим уклоном и снабжать их трапами, позволяющими быстро удалять воду с поверхности пола. Стены и полы предприятий ферментной промышленности выполняются из керамической облицовочной плитки для улучшения санитарных условий. При размещении оборудования и коммуникаций учитывается необходимость удаления пыли с выступающих частей оборудования и особенно с вентиляционных коробов. Потолок, верхнюю часть стен и оборудование следует чаще красить для поддержания соответствующих гигиенических условий.В случае работы с микроскопическими грибами и при повышенной влажности воздуха наблюдается рост микроорганизмов на стенах и в малодоступных запыленных местах, что создает антисанитарные условия труда. В таких случаях рекомендуется их красить фунгицидными красками. Фунгицидные краски могут быть пяти типов: 1) на основе хлорированного каучука. Они устойчивы к высокой относительной влажности воздуха, но очень трудно наносятся на поверхность; 2) с высоким содержанием галондозамещенного фенола (например, пентахлорфенола); 3) содержащие органические соединения меди (например, медь-8-хннолат или нафтенат меди); 4) содержащие ртуть или оловоорганические соединения (например, фенилмеркуриолеат, дифенилртуть и др.); 5) с высоким содержанием цинка.На предприятии должен осуществляться строгий и постоянный контроль за наличием в воздухе токсических газов и паров. Некоторые вещества легко обнаруживаются по запаху даже в концентрациях, меньших установленных нормами (хлороформ, этиловый эфир, ацетальдегид, аммиак, бром, метанол) - от 0,3 до 600 мг в 1 м3 воздуха в зависимости от соединения. Другие вещества могут содержаться в воздухе в значительно больших количествах, чем допускается по нормам, но не будут замечены работающими. Это более опасно, так как может привести к отравлению.Существуют специальные нормы предельно допустимых концентраций (ПДК) в воздухе помещений ряда химических веществ.В ряде помещений предприятий ферментной промышленности могут создаваться неблагоприятные климатические условия в результате несоблюдения оптимальной температуры, влажности, скорости движения воздуха, повышенного излучения тепла оборудованием. Эти факторы ухудшают самочувствие и работоспособность персонала, повышаются утомляемость и потоотделение, которое может увеличиться по сравнению с нормой в 8 - 10 раз и достичь 350 - 400 г/ч теряется тканевая жидкость, и наступает состояние чрезмерной усталости и слабости. Нормальные климатические условия в помещениях должны устанавливаться с помощью приточно-вытяжной вентиляции, а также путем максимальной автоматизации и механизации процессов и управления ими из специальных помещений с кондиционированным режимом. Все аппараты, излучающие тепло или холод, должны покрываться надежным изоляционным покрытием. Если избежать неблагоприятных климатических условий невозможно, то для поддержания нормального водно-солевого баланса организма необходимо обеспечить работающих подсоленной газированной водой (3 - 5 г соли на 1 л).Цехи, связанные с использованием растворителей и других химических веществ, должны тщательно вентилироваться, а воздух этих помещений - контролироваться на присутствие токсических газов и паров. Повышенное содержание химических веществ в воздухе производственных помещений часто связано с неисправностью трубопроводов, с неправильной установкой и эксплуатацией кранов и вентилей, а также с нарушениями герметизации фланцевых соединений разъемных аппаратов, например в результате разбухания и износа прокладочных материалов. Такие явления крайне опасны, так как они могут привести не только к ухудшению условий работы, но и к аварии, поэтому необходимо регулярно и тщательно проверять аппараты, вентили и соединения на герметичность.Промышленное производство любых продуктов, в том числе ферментных препаратов, организуется на основании технологического регламента, где обязательной частью является раздел «Основные правила безопасности ведения процесса». На заводе для каждого аппарата узла технологической схемы разрабатываются инструкции по технике безопасности, которые вывешиваются на видном месте.Безопасность условий труда во многом зависит от своевременного проведения планово-предупредительного ремонта (ППР), внутреннего наружного осмотра оборудования по определенному графику в период работы завода между капитальными ремонтами. Перенесение сроков текущего ремонта, установленных месячным графиком ППР, запрещено, изменение сроков более 2 дней допускается только с разрешения главного инженера и оформляется актом.Взрыво- и пожаробезопасность. Производство ферментных препаратов часто связано с использованием легковоспламеняющихся веществ поэтому относится к категории взрыво- и пожароопасных производств. Источниками взрыва пожара на предприятиях ферментной промышленности могут быть различные органические растворители в цехах выделения ферментных препаратов на участке регенерации растворителей. Взрывоопасны также цехи с высокой запыленностью, особенно, где есть места скопления мельчайшей пыли ферментных препаратов, где используется пневмотранспорт, установлены распылительные сушилки, складские помещения и т. д. Степень пожарной опасности определяется свойствами жидкостей: пределом взрываемости (воспламенения) паров в воздухе; температурой самовоспламенения паров жидкости в воздухе; склонностью данной жидкости к самовозгоранию в определенных условиях и к электролизации. Категории пожароопасности помещений определяются в соответствии со строительными нормами правилами (СНиП).Особую пожарную опасность представляют цех получения очищенных ферментных препаратов с помощью органических растворителей и цех по регенерации органических растворителей. Эти цехи должны быть изолированы от смежных невзрывоопасных помещений глухими (брандмауерными) стенами, сообщение между ними допускается только по специальным переходам. Они должны иметь специальный пожарный выход, а при высоте помещения больше 10 м - наружную металлическую пожарную лестницу с уклоном не более 45° и шириной не менее 0,7 м. Взрывоопасные помещения должны покрываться только легко сбрасываемыми при взрывной волне кровельными перекрытиями.Все электродвигатели, пусковые устройства которых могут искрить, должны быть герметизированы и изготовлены во взрывобезопасном исполнении. Электрооборудование должно удовлетворять требованиям, изложенным в Правилах устройства электроустановок (ПУЭ).Емкости для хранения растворителей устанавливают на значительном расстоянии от производственного здания по основному направлению ветра для данной местности. Безопасность хранения легковоспламеняющихся и горючих жидкостей обеспечивается путем установления в резервуарах и цистернах выхлопного клапана и огнепреградителя.Трубопроводные линии для легколетучих и взрывоопасных жидкостей окрашивают в коричневый цвет и удаляют от других коммуникаций.От прямых ударов молний предусматривается оборудование громозащиты. Для защиты от проявления статического электричества всю аппаратуру, металлоконструкции, трубопроводы и емкости с органическими растворителями, воздуховоды и резервуары заземляют.Все оборудование, имеющее открытые вращающиеся или движущиеся элементы, закрывают защитными коробами или сетками.Оборудование и установки, издающие шумы, должны по возможности герметизироваться и устанавливаться на амортизационных подушках или в специальных помещениях.Оборудование и устройство бытовых помещений (кроме туалетных, курительных комнат и помещений для кормления грудных детей) осуществляются в зависимости от санитарной характеристики производственных процессов.Повышенная взрыво- и пожароопасность ферментных предприятий, разнообразие используемых аппаратов и устройств, опасность, которую представляют продуценты ферментов, вызывают необходимость тщательного изучения и освоения правил техники безопасности и промышленной санитарии. Занятия, инструктаж и проверку полученных знаний и навыков следует проводить не реже 1 раза в квартал. Каждый вновь поступающий на работу проходит обязательный инструктаж. Изучение правил техники безопасности и правил промышленной санитарии обязательно для каждого студента.Инструкции по технике безопасности и правила санитарии разрабатываются для каждого рабочего места, выдаются на руки исполнителям и вывешиваются на видных местах. Инженерный персонал завода должен внимательнейшим образом следить и неукоснительно исполнять сам все правила техники безопасности и промышленной санитарии. Ответственность за соблюдение правил охраны труда несут руководители подразделений, а в целом по предприятию - директор и главный инженер. 2. Производство протеолитических ферментных препаратовФерменты, обладающие способностью гидролизовать белки, широко используются в самых различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Протеолитические ферменты выпускаются промышленностью в большом количестве, это крупнотоннажное производство. Протеиназы применяются в пищевой технологии, где идет процесс с использованием микроорганизмов (дрожжи, молочнокислые бактерии и др.). Введение в процесс протеиназ позволяет в результате гидролиза белков обрабатываемого сырья обеспечить дрожжам нормальные условия жизнедеятельности, что улучшает весь технологический процесс, особенно в пивоварении, спиртовой промышленности, виноделии. В ряде исследований показано, что протеолитические ферменты могут использоваться в хлебопечении для уменьшения длительности замесов при производстве заварных сортов хлеба и специальных изделий, изготавливаемых из муки с сильной клейковиной. Внесение в тесто небольших количеств амилаз и протеиназ увеличивает газообразование, улучшает аромат, цвет корочки и мякиша, позволяет сократить процесс тестоведения. Широко применяются протеиназы для снятия различного рода белковых помутнений в пивоварении и виноделии и для ускорения фильтрационных процессов. Протеолитические ферменты используются для мягчения (тендеризации) мяса, мясных изделий, рыбы, что облегчает и ускоряет обработку полупродуктов, повышает их качество. В мясной, рыбной промышленности и в кулинарии используются не только микробные протеиназы, но и протеиназы, получаемые из растительного и животного сырья. Высокоочищенные протеолитические ферменты могут с успехом использоваться в крахмало-паточной промышленности для выделения особенно чистого крахмала без сопутствующих белков.Комплексные ферментные препараты, содержащие протеиназы, используются в пищеконцентратной и консервной промышленности при приготовлении концентратов из трудно развариваемых круп, гороха, фасоли и др.Протеииазы могут использоваться в кожевенной промышленности для обработки кож в процессе их обезволашивания и мягчеиия с большим эффектом: улучшается качество шкуры, сохраняется толщина готовой кожи, отделенная щетина может использоваться как вторичное сырье, а главное - резко улучшаются условия труда работающих. Используются протеиназы при обработке натурального шелка для процесса снятия белка с поверхности шелковой нити.Самая большая потребность в протеолитических ферментах связана с их использованием в составе синтетических моющих средств (CMC). Особенно эффективна обработка протеиназосодержащими CMC больничного белья, загрязненного кровью и другими выделениями белковой природы.Протеолитические препараты, особенно животного происхождения, широко используются в медицинской промышленности и медицине. Они применяются для приготовления питательных и диагностических сред, для изготовления ряда лечебных сывороток и вакцин. Протеиназы различной степени очистки используются в качестве лекарственных препаратов для регулирования процессов свертывания крови, при лечении воспалительных процессов, для восполнения недостатка ферментов в организме и т. д.2.1 Источники получения протеиназПротеолитические ферменты синтезируются практически всеми живыми существами. Эти ферменты очень широко распространены в природе. В промышленных целях как источник получения протеиназ используются животные ткани, растения и микроорганизмы. Животными тканями для получения протеиназ является собираемое на мясокомбинатах ферментное сырье, состоящее из поджелудочной железы и слизистой оболочки желудка. Из растений промышленный интерес представляют плоды дынного дерева, побеги и листья инжира и отходы переработки ананасов.Наиболее широким и перспективным источником протеиназ являются микроорганизмы. Активными продуцентами протеиназ являются бактерии, микроскопические грибы и актиномицеты. Можно назвать сотни микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, которые используются при промышленном получении протеиназ. Они чаще всего относятся к родам Bacillus,Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, Pseudomonas и некоторые другие. Более подробно о продуцентах будет сказано в разделе, посвященном рассмотрению особенностей производства протеолитических препаратов.2.2 Механизм действия, свойства и классификация протеиназСубстрат. Субстратами для действия протеолитических ферментов являются пептиды и белки. К последним относятся простые белки, состоящие только из аминокислот, их называют протеинами, и сложные белки, в состав которых наряду с белковой частью молекулы входят соединения небелковой природы (углеводы, витамины, жиры и др.) - протеиды. Все эти соединения имеют большую молекулярную массу и сложны по строению.Пептиды также могут быть субстратом для протеиназ. Они имеют более низкую молекулярную массу, чем белки, и по составу подобны простым белкам. Они могут быть либо продуктами неполного гидролиза белка, либо природными соединениями. Пептиды могут быть синтезированы в лаборатории и использоваться как специфические субстраты в аналитических работах для определения способности ферментов к разрыву вполне определенных пептидных связей.До начала 50-х годов все протеолитические ферменты по механизму их действия на субстрат подразделялись на две группы: протеиназы и пептидазы. Считалось, что гидролиз белка протекает в две стадии: сначала под действием протеиназ белки гидролизуются до пептидов, а затем на пептиды действуют пептидазы и расщепляют их до аминокислот.
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
