Оценка влияния микробиологических препаратов на тлей и их энтомофага - хищную галлицу Aphidoletes aphidimyza Rond

Гетерогенная группа, для всех таксонов которой характерны клеточные стенки, содержащие L-ДАПк - диаминопимелиновая кислота и глицин. Нити не распадаются на фрагменты и могут образовывать обильный воздушный мицелий с длинными цепочками спор (Заварзин Г.А. (ред.), 1997). Воздушный мицелий - густая, пушистая масса, поднимающаяся с поверхности колонии. Здесь образуются спорангии. Длина гиф воздушного мицелия может достигать 500 мкм.

Род Streptomyces

Вегетативные гифы (диаметром 0,5-2,0 мкм) образуют обильно разветвленный мицелий, редко распадающийся на фрагменты. Воздушный мицелий в зрелом состоянии несет цепочки из трех или большего числа спор. Для нескольких видов характерны короткие цепочки спор на субстратном мицелии (Вулфа Л., 1974). Некоторые виды могут формировать склероцио-, пикнидио-, спорангио- и синнема-подобные структуры. Споры неподвижные. Колонии обособленные и лишайникоподобные, кожистые или маслянистые; поверхность вначале относительно гладкая, но затем формируется переплетение воздушного мицелия, который может быть хлопьевидным, зернистым, порошковидным или бархатистым. Субстратный мицелий погружен в глубину питательной среды, гифы субстратного мицелия поглощают питательные вещества. В таком случае колония актиномицета легко снимается петлей с поверхности среды. Образуют разнообразные пигменты, определяющие цвет субстратного и воздушного мицелия. Могут также синтезировать пигменты, диффундирующие в среду. Многие штаммы, продуцирующие один или большее число антибиотиков. Грамположительные, но не кислото- и спиртоустойчивые. В составе пертидогликана клеточной стенки большое количество L-ДАПк. Не содержит миколовых кислот, но в больших количествах содержат насыщенные жирные кислоты изо- и антеизо-строения; основные изопреноидные соединения - гекса- или октагидрированные менахиноны с 9 изопреновыми единицами. В составе сложных полярных липидов обычно присутствуют фосфатидилглицерол, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфатидилинозитолманнозиды. Аэробы. Хемоорганотрофы; метаболизм окислительного типа. Каталазоположительные; как правило, восстанавливают нитрат до нитрита; разлагают аденин, эскулин, казеин, желатину, гипоксантин, крахмал и L-тирозин. В качестве единственных источников углерода и энергии для роста используют разнообразные органические соединения. Оптимальная температура 25-35єС, некоторые виды растут как психрофильные и термофильные; оптимальный для роста диапазон рН 6,5-8,0. Широко распространены и обильно представлены в почве, включая компосты. Несколько видов патогенны для животных и человека, другие фитопатогенные (Заварзин Г.А. (ред.), 1997).

Род Streptomyces представлен видами, имеющими воздушный мицелий, несущий цепочки спор. Многие штаммы продуцируют антибиотики. Streptomyces albus - продуцент стрептомицина, Streptomyces griseus, Streptomyces lavendulae - продуценты биопрепарата фитолавина, используемого против фитопатогенов, Streptomyces scabies - возбудитель обыкновенной (актиномицетной) парши картофеля и корнеплодов (син. Actinomyces scabies) (Шапиро Я.С., 2005).

тля теплица грунт энтомофаг микробиологический

1.3.2 Распространение и экология

Актиномицеты присутствуют в воздухе, пресноводных водоемах и морях, а также в донных осадках. Почвы являются природными субстратами, откуда актиномицеты выделяются в наибольшем числе и разнообразии, принимая активное участие в почвообразовательных процессах. Они широко распространены в почвах всего земного шара, однако на их качественный и количественный состав значительное влияние оказывает географическое положение местности, тип почвы, ее химические и физические свойства, окультуренность, влагоемкость и др. особенности почв (Банников А.Г., Вакулин А.А., Рустамов А.К., 1996).

Актиномицеты в большом количестве встречаются в почве благодаря их способности легко адаптироваться к среде обитания и довольствоваться органическими соединениями, которые непригодны для других микроорганизмов. В почвах содержится от 19,7 до 46% актиномицетов от числа всех микроорганизмов, населяющих почву (Гаузе Г.Ф., Преображенская Г.П., Терехова Л.П., Максимова Т.С., Аверичева Л.Н., 1982).

1.3.3 Препараты на основе актиномицетов рода Streptomyces

Среди почти 14000 известных биоактивных микробных вторичных метаболитов около 9000 продуцируются актиномицетами, 80% которых относятся к роду Streptomyces (Berdy I., 1994, p.27). Широкое распространение актиномицетов в природе (в почвах, например, их содержится 20-46% от числа всех микроорганизмов), богатое функциональное разнообразие, высокая биосинтетическая активность и простота культивирования делают их весьма перспективными продуцентами новых биопрепаратов, эффективных в борьбе с вредными насекомыми. Из 3200 известных продуцентов антибиотиков 2100 - актиномицеты (из них 1900 - стрептомицеты), 830 - грибы, 270 - бактерии. Большинство выделенных вторичных метаболитов, синтезируемых актиномицетами, обладают антибиотическими свойствами (антимикробными, антивирусными) (Русанова Е. П., Алехова Т.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., 2000, том 36, №3). В настоящее время описан ряд веществ с другим характером биологического действия: ингибиторы ферментов, гербициды, инсектициды, находящие применение в растениеводстве (Коробкова Т.П., Иваницкая Л.П., Дробышева Т.Н., 1987, №8; Лобанок А.Г., Ялашко М.В., Анисимова Н.И., 1988). Наибольшее их количество найдено среди метаболитов актиномицетов рода Streptomyces (Головлева Л.А., Черменский Д.Н., 1988).

По данным Государственного Каталога пестицидов на 2004 год зарегистрировано 36 биопрепаратов, разрешенных к применению на территории РФ, из них 5 бактериальные: Вертимек, Фитоверм, Фитоверм-М, Акарин и Искра Био, но промышленное производство некоторых из них не налажено. Тем не менее, использование биологических средств защиты растений является одним из основных элементов в создании современных технологий фитосанитарной оптимизации агроэкосистем. В связи с этим актуальной является проблема поиска в различных местах обитания новых микроорганизмов, продуцирующих биологически активные вещества с широким спектром инсектицидного действия. Следует отметить, что 99% всех существующих биопрепаратов - бактериального происхождения (Кандыбин Н.В., 1991, №1). Однако во всем мире усилилось внимание к энтомопатогенным и энтомотоксичным актиномицетам, в особенности, к стрептомицетам. Создан ряд препаратов: актинин, глоберин, летарцид (Streptomyces globisporus), авермектины (Streptomyces avermitilis), боррелидин (Streptomyces griseus), хризомал (Streptomyces chrisomalus), индоцид-5 (Streptomyces ceneoruber), индоцид-6 (Streptomyces loidensis). Учитывая богатое разнообразие стрептомицетов и их высокую метаболическую активность, можно с уверенностью сказать, что эта группа микроорганизмов таит в себе неисчерпаемые возможности (Bettine Lauer, Roderich Submuth, Dietmar Kaiser, Gunther Junj and Christian Borman., 2000, v. 53, №4).

В результате исследований, проведенных в ВИЗР, из почв различных географических регионов выделены изоляты стрептомицетов с инсектоакарицидной активностью в отношении тлей, оранжерейной белокрылки, трипсов, клещей и т.д. Высокая специфичность и эффективность в отношении вредоносных объектов в широком интервале гидротермических условий, низкая токсичность и быстрый распад в аэробных условиях, стабильность метаболитных комплексов показали возможность их использования в качестве основы новых биопрепаратов.

Алейцид представляет собой смачивающийся порошок или пасту красно - оранжевого цвета с характерным запахом, слабо растворимый в воде, содержит активный комплекс метаболитов, действующим веществом которого является 9-диметилпиерицидин. Контактный препарат. Продуцент алейцида - штамм 0775 выделен Коневым Ю.Е. из почвенного образца № 8242/32, собранного в дендрарии г. Сочи. По культурально-морфологическим признакам и физиолого-биохимическим признакам продуцент является типичным представителем вида Streptomyces aurantiacus с выявленными штаммовыми отличиями.

При использовании препарата наблюдается не только смертность, обусловленная непосредственным действием токсинов, но и последействие - гибель на последующих стадиях развития, а также снижение жизнеспособности насекомых и тератогенный эффект.

Результаты лабораторных, вегетационных и производственных опытов показали высокую биологическую эффективность алейцида в отношении сосущих вредителей сельскохозяйственных растений различных видов тлей, оранжерейной белокрылки, табачного трипса, морковной листоблошки и сетчатого слизня. В лабораторных условиях обработка популяций персиковой, бобовой, виковой, картофельной, гороховой 0,1-1% суспензией препарата через 2 часа вызывала смертность 57,1-97,3% вредителей. Наиболее чувствительными к воздействию препарата оказались гороховая, бобовая и виковая тли.

Алейцид показал высокую эффективность в отношении всех стадий развития оранжерейной белокрылки, личинок морковной листоблошки и сетчатого слизня, а также проявляет акарицидные свойства при обработке от паутинного клеща (Бойкова И.В., Павлюшин В.А., 2002, стр. 102).

Недавно разработана улучшенная препаративная форма Алейцида, получившая название Алейцид-М, которая по своим показателям экологической безопасности (фитотоксичности) значительно превосходит ранее полученные образцы при сохранении высокой инсектицидной активности. Алейцид-М безопасен для растений, теплокровных животных и человека в рекомендуемых концентрациях, соответствуют требованиям экологической безопасности систем защиты овощных, декоративных, плодовоягодных культур в открытом и защищенном грунте. Однако в список пестицидов, разрешенных для применения, препарат не включен.

Индоцид-6. Препарат разработан в ВИЗР на основе штамма П-56 актиномицета Streptomyces loidensis, выделенного из образца индийской почвы. В состав препарата входит комплекс метаболитов (производных пептидов), обладающих высокой инсектицидной активностью в отношении различных видов тлей, трипсов, паутинных клещей. Против этих вредителей Индоцид-6 производят в виде смачивающего порошка или в жидкой форме, которая с экономической точки зрения предпочтительнее, поскольку в этом случае не требуется дорогостоящая стадия сушки. По данным многочисленных вегетационных испытаний, обработка популяций персиковой тли суспензией препарата в концентрации 0,025-0,1% через 4 часа вызывает гибель 70-100%, а через 6 часов - 90-100% особей. Смертность паутинно клеща через сутки после обработки суспензией препарата в концентрации 0,05-0,1% достигает 87%.

В виде сухой торфяной формы препарат перспективен для использования против галловых нематод р. Meloidogyne. При внесении в лунки перед посадкой растений 5-10 г препарата степень пораженности растений мелойдогинозом снижается до 2 балла (в контроле - 5 баллов).

Интересным свойством препарата является его комплексное действие на растения. В концентрации 0,01-0,05% Индоцид-6 проявляет выраженную фиторегуляторную активность: стимулирует рост и увеличивает массу корней и стеблей огурца, улучшает биохимический состав плодов.

Препарат контактного действия. Норма расхода препарата 0,5-1 кг/га. Концентрация рабочей суспензии 0,05-0,1%. Применяются методом опрыскивания насекомых в очагах размножения водной суспензией препарата. Хранение до 2-х лет при 4-6 єС.

Препарат обладает стимулирующим действием на растения. Возникновения устойчивости к препарату у насекомых не отмечено.

Индоцид-6 безопасен для растений, теплокровных животных и человека в рекомендуемых концентрациях, соответствуют требованиям экологической безопасности систем защиты овощных, декоративных, плодовоягодных культур в открытом и защищенном грунте. Однако в список пестицидов, разрешенных для применения, препарат не включен (Ахатов А.К., Ижевский С.С. (ред.), 2004; Бойкова И.В. и др., 1999).

Среди представителей различных групп препаратов наиболее полному экспериментальному изучению с целью их практического использования подвергались авермектины, милбемицины, акдион, антимицины, тетранактин, пиерицидины.

Большое количество публикаций касается интересной и широко применяемой в с/х группы биоинсектицидов - авермектинов. Авермектины выделены японскими учеными в конце 70-х годов из продуктов жизнедеятельности почвенных актиномицетов вида Streptomyces avermitilis. Препараты широко изучены в качестве инсектоакарицидов и нематицидов (Цизин Ю.С., Бронштейн А.М., 1986, №10). Получен целый ряд производных авермектинов, обладающих инсектицидной активностью. Авермектины - высокоэффективные биопрепараты в борьбе с вредителями с/х растений, экзо - и эндопаразитами животных и синантропными насекомыми. В защите растений наиболее широко применяется препарат с шифром МК - 936.

Авермектин обладает свойствами регулятора роста насекомых и высокой акарицидной активностью в отношении растительноядных клещей.

К недостаткам авермектинов относят их высокую токсичность для теплокровных животных. Так, ЛД50 для белых крыс при пероральном введении составляет 10 мг/кг, однако в применяемых дозах (расход 30 г/га) не вызывает интоксикацию. Кроме того, авермектины быстро разлагаются в аэробных условиях. В опесчаненном и илистом суглинке под с/х культурами при внесении 0,1 мг/кг полупериод жизни составляет 3-4 недели. Особенно активно разложение происходит в щелочных почвах. В анаэробных условиях авермектин не разлагается.

В настоящее время зарубежные фирмы Японии, Голландии, США, Бразилии, Германии, Франции выпускают коммерческие препараты на основе авермектинов: Абамектин, Авид, Агри-мек, Аффирм, Вертимек, Ивомек, Экволан.

В результате направленного скрининга, на основе штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 в НБЦ «Фармбиомед» создан биопрепарат Фитоверм, успешно прошедший производственные испытания. Это единственный отечественный препарат на основе штамма Streptomyces avermitilis, внесенный в список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории России (Кобзарь В.Ф., 1995). Действующее вещество Фитоверма - Аверсектин С. Выпускается в форме концентрата эмульсии (2 г/л).

Фитоверм обладает нейротоксическим действием. Действующее вещество препарата относится к высокотоксичным соединениям (класс авермектинов), но в готовых продуктах их концентрация настолько мала, что они отнесены к 4 классу опасности. Обладает высокой биологической эффективностью в отношении колорадского жука на картофеле, растительноядных клещей, бахчевой и персиковой тлей, листоблошек и трипсов на овощных и декоративных культурах защищенного грунта. Не является специфическим инсектоакарицидом поэтому для борьбы с насекомыми используют повышенные концентрации. Против тлей препарат эффективен (на уровне 80-98%) при концентрации рабочего раствора 0,8% с нормой расхода препарата 1-3 л/га (1 мл на 1 л воды). В борьбе с трипсами рекомендуются обработки 1% раствором при норме расхода препарата 10-30 л/га (10 мл на 1 л воды).

Большое количество работ посвящено изучению обширной группы 16-членных макроциклических соединений - милбемицинов.

Милбемицины были открыты в 70-х годах в Японии в результате широкого направленного поиска инсектицидов микробного происхождения. Их продуцентом является Streptomyces nigroscopicus, образующий смесь биологически активных веществ. Милбемицины, как и авермектины, не проявляют антибактериальной активности, но обладают широким спектром нематицидного действия, а также проявляют инсектицидные и акарицидные свойства в отношении широкого круга вредителей с/х культур и гельминтов крупного рогатого скота.

Среди инсектицидных метаболитов актиномицетов обнаружены вещества, как общетоксического действия (авермектины, милбемицины, празиноны и др.), так и специфические регуляторы роста и развития насекомых, в частности, ингибиторы синтеза хитина - никкомикомицины.

Широким спектром инсектоакарицидного действия обладает пиерицидин и его производные. Наиболее изучены биологические свойства пиерицидинов А и В. Эти препараты высокоэффективны в отношении комнатной мухи, рыжего таракана, стеблевого бурильщика, шелковичного червя, репной белянки, персиковой тли, бобовой и гороховой тлей (Самоукина Г.В., Кандыбин Н.В., 1981, том 51; Самоукина Г.В., 1983, том 53).

В институте с/х микробиологии г. Санкт-Петербурга создан препарат Актинин (Самоукина Г.В., Кандыбин Н.В., Сергеева М.В., Бортник Н.И., 1990).

Актинин - актиномицетный препарат, создан на основе актиномицета Streptomyces globisporus штамма 0234 при глубинном культивировании (ВНИИ с/х микробиологии). Препаративная форма - жидкость, порошок, концентрат - Л, концентрат - М. Действующее вещество - эндометаболиты нонактиновой группы. Жидкая форма - культуральная жидкость, или ее высушивают, и порошок применяют в виде водной суспензии. Актинин-Л и Актинин-М получают концентрированием культуральной жидкости, экстрагированием и фильтрацией.

Препарат эффективен (на уровне 85-100%) против паутинного клеща на овощных культурах защищенного грунта при норме расхода Актинина-Л - 100-200 л/га, расход рабочего раствора 1000-3000 л/га; против колорадского жука на картофеле при норме расхода 4 кг/га, расход рабочего раствора 150-400 л/га (Новикова И.И., Бойкова И.И., Павлюшин В.А., Матевосян Г.Л., Паршин В.Г., № 33, 2002; Павлюшин В.А., Агасонова Н.Е., 2001). В список пестицидов, разрешенных для применения, препарат не внесен.

В последние годы появились сообщения об использовании антрациклиновых антибиотиков и их производных для защиты растений. Большой резерв для открытия новых эффективных биопрепаратов кроется не только в выделении новых продуцентов, но и в более полном изучении их биологического потенциала.

Для успешного применения метаболитных препаратов в защите растений необходимо расширять поиск новых БАВ природного происхождения с различными механизмами действия, а, следовательно, необходимо совершенствовать стратегию скрининга микроорганизмов-продуцентов, использования достаточно широкий набор тестов.

Таким образом, по ряду показателей, а именно: отсутствию фитотоксичности, возможности совместного использования с энтомофагами; низкой токсичности и быстрому распаду в аэробных условиях; высокой специфичности и эффективности в отношении целевых вредоносных объектов в широком интервале гидротермических условий; биопрепараты на основе актиномицетов весьма перспективны для современных фитосанитарных технологий и, в частности, для комплексных систем защиты растений.

2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Место проведения опытов и материалы

Исходным материалом для исследования в лабораторных условиях послужили пятнистая оранжерейная тля (Neomyzus circumflexus Buckt.) и лабораторная Санкт-Петербургская популяция хищной галлицы Aphidoletes aphidimyza Rond. (Diptera, Cecidomyiidae). Для выкармливания личинок галлицы использовали виковую тлю. Для обработок использовали: препараты на основе актиномицетов, выделенные из штаммов Streptomyces sp.

Характеристика препаратов

1. П-56 - на основе штамма Streptomyces loidensis, выделенного из почв Индии, является основой препарата Индоцид. В состав препарата входит комплекс метаболитов, обеспечивающий высокую инсектицидную активность против ряда вредных сосущих членистоногих: различных видов тли, трипса, паутинного клеща.

Показано, что компоненты комплекса, ответственные за инсектицидную активность, по химическому составу относятся к пептидолактонам треонинового типа. Работа по их идентификации продолжается.

Из П-56 выделен клон П-56-1, с отличным от исходного комплексом метаболитов, действие которого на насекомых еще изучается.

2. Streptomyces herbaricolor S-100 изолирован при микробиологическом обследовании дерново-подзолистых почв Западной Сибири вблизи г. Тюмени в 1989 году. Данные препараты находятся на стадии разработки.

Из S-100 был выделен клон с комплексом метаболитов, содержащий красный красящий пигмент. Поэтому далее мы называем его S-100кр.

Нами были проведены следующие эксперименты:

1) Оценка влияния микробиологических препаратов 729, 925, П-56, П-55, S-100 на выживаемость и развитие пятнистой оранжерейной тли;

2) Оценка влияния на выживаемость галлицы афидимизы при обработке препаратами П-56-1 и S-100кр. афидофага на эмбриональной, личиночной и на стадии кокона (сразу после окукливания и спустя некоторое время) инсектицидами микробиологического происхождения на основе штаммов Streptomyces sp. (далее препараты П-56, П-56-1, S-100, S-100кр.), которые были получены в результате скрининга коллекционных, а также свежевыделенных из почв изолятов, в лаборатории микробиологического метода защиты растений №8, ВИЗР.

2.1.2 Методы

Работа по оценке влияния преператов микробиологического происхождения на тлей и галлицу выполнялась в 2005 году в лаборатории биометода №7, ВИЗР под руководством с.н.с. Козловой Е.Г. совместно с лабораторией микробиологического метода защиты растений №8, ВИЗР.

2.1.3 Разведение виковой тли

Бобы выращивают в стеклянных банках (емкостью 0,5 л) с обычной водопроводной водой. Банки закрывают полиэтиленовыми крышками, в которых пробито по 10 отверстий диаметром 5-7 мм. Семена овощных бобов замачивают на 1 день в 0,5%-ном растворе марганцовки. Затем семена размещают ровным слоем на противень со стенками высотой 5-6 см, засыпают смесью древесных опилок и стружки и ставят на стеллаж. После появления семядольных листьев растения высаживают в отверстия крышки, сохраняя одно незанятым для полива, банки ставят на тот же стеллаж и заселяют бобы виковой тлей, раскладывая кусочки листьев с тлей (Бондаренко Н.В., Воронова О.В., 1989). Разведение пятнистой оранжерейной тли осуществляли таким же образом, как и виковой.

2.1.4 Разведение галлицы

Разведение галлицы проводили по методике Бондаренко Н.В., Асякина Б.П., 1975 г. Для получения яйцекладок галлицы, в садках размером 35Ч35Ч35 см постоянно поддерживали высокую плотность популяции имаго галлиц. Для этого 2 раза в неделю в садки помещали коконы (1-2 тысячи). Затем в каждую секцию на 1 день помещали 2-3 банки с бобами, заселенными виковой тлей. Кроме того, в садки помещали чашки Петри с кусочком поролона, поставленные в каждую секцию садка, наливали 10 %-ный сахарный сироп.

Вынутые из садка банки с растениями, на которых отложены яйца галлиц, переносили на стеллаж на 3 дня до полного отрождения личинок. Отрождающиеся личинки питались тлями, находящимися на растениях.

Потом просеянный и обеззараженный влажный песок насыпали на дно кристаллизатора слоем 1 см. Срезали с трех-шести банок растения (в зависимости от численности личинок) и выкладывали на поверхность песка. Затем накрывали рамкой затянутой капроновой тканью, чтобы тли не расползались. Ежедневно, в течение семи последующих суток в кристаллизатор добавляли для питания личинок растения с тлями. Через 5 суток после окукливания, точнее ухода личинок в песок, с его поверхности удаляли все остатки растений, а затем отделяли коконы. Для этого просеивали песок с коконами через сито (с отверстиями 1 мм).

2.1.4.1 Оценка влияния микробиологических препаратов на пятнистую оранжерейную тлю в лабораторных условиях

Препараты применялись в концентрации 0,1%, 0,2%. Обработку проводили ручным лабораторным пульверизатором. Каждый вариант опыта закладывали в 5 повторностях. В опыте мы использовали пластиковые контейнеры, которые накрывали тканью с отверстием посередине и сажали в него росток боба и кисточкой подсаживали тлю. На каждом растении находилось в среднем по 9-10 личинок тли старшего возраста. Контролем служили тли, обработанные водой (влажный контроль). Обрабатывали ростки бобов с тлей и ламповое стекло, которым накрывали ростки. После обработки ламповое стекло накрывали двойным слоем марли. Подсчет тли проводили через день, подсчитывая число тли в каждом варианте. В таблицу вносили данные в % по отношению к первому дню, в который проводили обработку, т.е. число тли в первый день принимали за 100% во всех вариантах, а в последующие дни учета численность тли сравнивали с первым днем и вычисляли по формуле: , где Х - % выживших тлей по отношению к первоначальному числу тли; А - число тли на день учета, шт.; В - общее число обработанной тли каждого варианта, шт. Обработку проводили в фазу личинок 3 возраста тли. Также вычисляли скорость нарастания популяции тли по формуле: , где InA - численность тли в день А, InB - численность тли в день В, n - количество дней.

Страницы: 1, 2, 3, 4