Определение способности почвенных бактерий к разложению синтетических моющих средств
p align="left">Они не только усиливают проникновение АПАВ через кожу, но и увеличивают накопление этих веществ на волокнах тканей, подвергающихся стирке. Они способствуют такому прочному сцеплению АПАВ с тканью, что даже 10-кратное полоскание в горячей воде не приводит к полному освобождению одежды от АПАВ. Причем чем сложнее и разветвленнее структура волокна, тем большее количество молекул АПАВ могут к нему «прилипнуть». Сильнее всего держат ПАВ шерстяные, полушерстяные и хлопчатобумажные ткани. В среднем, потенциально небезопасные концентрации ПАВ сохраняются на тканях до 4 суток. Таким образом, создается очаг постоянной интоксикации внутри самого организма. Прочно закрепившись на одежде, молекулы АПАВ при соприкосновении с кожей относительно легко переносятся на ее поверхность и быстро всасываются внутрь, начиная свой разрушительный маршрут по организму (www.ecocoop.ru).
Говорят, что капля никотина убивает лошадь. Вот научный факт: 100 г. ПАВ убивают лошадь весом в 300 кг в течение 24 часов (Голубева, 2006).
Проанализировав теоретический материал можно сделать вывод, что поверхностно-активные вещества несут серьезную угрозу загрязнения окружающей среды, так как многие из них имеют сложное химическое строение, что затрудняет разрушение их в природе. Накапливаясь в почве, воде такие вещества могут оказывать неблагоприятное воздействие на живые организмы, в том числе и человека. Важную роль в разрушении таких загрязнений играют микроорганизмы. Поэтому, на мой взгляд, поиск и изучение таких микроорганизмов в настоящее время является важной задачей.
2. Объекты и методы исследованийОбъектом исследования являются чистые культуры микроорганизмов, выделенные из почв. В работе использовано 13 культур микроорганизмов, большинство из которых является Г+ спорообразующими аэробными палочками. Чистые культуры хранились в холодильнике в пробирках со скошенным питательном агаром. Перед началом исследований было произведено обновление штаммов, путем подращивания их на МПБ с последующим пересевом на ПА.2.1 Методы исследований2.1.1 Исследование физиолого-биохимических свойствДля исследования физиолого-биохимических свойств микроорганизмов использовались дифференцировочные пластины. Пластина представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикаторами, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой. Панель и крышка изготовлены из полистирола. Субстрат с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.Специфическое действие препарата заключается в возможности дифференцировать бактерии на основе определения ферментативных систем по их действию на соответствующие субстраты.Биохимические дифференцировочные пластины предназначены для определения ферментативной активности бактерий, выделяемых в ходе микробиологических исследований. Это может помочь при дальнейшей идентификации до рода и возможно вида.Подготовка исследуемых образцовПеред проведением исследования выделенные культуры подлежат изучению на чистоту.Идентификацию культур, непосредственно из нативного материала, производят со скошенного мясо-пептонного агара (МПА). Используют культуры выращенных в течение 18-24 часов при температуре при температуре 37 оС, без предварительного подращивания их на МПБ (мясо-пептонном бульоне).Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при комнатной температуре или в холодильнике, производят предварительный посев ее на МПБ на 2-4 часа при температуре 37 оС, затеи осуществляют пересев культуры на скошенный МПА. Посевы инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 37 оС.Культуру с МПА используют для приготовления суспензии в стерильной 1% пептонной воде рH 7,2-7,4 и доводят мутность суспензии до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей, стеклянному. При отсутствии отраслевого стандартного образца в 4,0 мл стерильной 1% пептонной воды вносят 2-3 петли исследуемой культуры до образования видимой мутности.Проведение исследования1. Вскрывают упаковку пластин.2. Регистрируют на крышке панели номер засеваемого штамма.3. Открывают крышку и располагают панель на столе.4. Добавляют пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии в стерильной 1% пептонной воде во все лунки панели, кроме 17,18,19 которые оставляют свободными.5. Для создания анаэробных условий добавляют 1-2 капли стерильного вазелинового масла в лунки для определения аргининдегидрогеназы и уреазы (№№11,20).6. Закрывают крышку панели.7. Выдерживают пластины в течение 18-24 часов при температуре 37 оС.Учет результатовУчет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, приложенным к пластинам, 18-24 часа инкубации при 37 оС.После окончания инкубации открывают крышку панели и в лунки для выявления ацетилметилкарбинола (№10) добавляют 1 каплю 6%-го раствора альфа нафтола и затем 1 каплю 40% раствора гидроокиси калия; для определения фосфатазы (№8) - 1 каплю 20% раствора гидроокиси натрия; для выявления нитратредуктазы (№9) добавляют 1 каплю реактива Грисса. Реакции учитывают немедленно в лунках №8,9, выявление ацетилметилкарбинола (№10) осуществляют через 15-20 минут после закапывания реактивов.2.1.2 Определение способности роста на средах с добавлением поверхностно-активных веществДля определения способности роста на средах с добавлением различных ПАВ использовался чашечный метод. Производился глубинный посев по 1 мл бактериальной суспензии. Использовалось 2 среды: питательный агар и среда М9 (рецепты сред см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также полиакриламид (ПАА) (НПАВ). ПАВ в количестве 1 мл вносились в среды перед стерилизацией (Турковская, 1997).2.1.3 Определение активностиОпределение способности штаммов подвергать деградации ПАВ определяли с помощью модифицированного нами метода лунок Турковской (Турковская, 1997,): в центре застывшей среды ПА/10 в чашках Петри стерильным пробочным сверлом вырезали лунку. Микроорганизмы высевались штрихом по радиусу от лунки к периферии чашки (посев производится секторами). Затем в лунку стерильно вносили исследуемое ПАВ. Контролем служили чашки с посевами без субстратов. Инкубирование проводили в термостате при 34 оС в течении 3 сут.Результаты оцениваются через 2-3 суток. Отмечается рост от края чашки к центру, к лунке с ПАВ. Степень активности характеризуется количеством баллов по сравнению с контролем.2.2 Материалы и оборудованиеКультуры микроорганизмов, пробирки, колбы, чашки Петри, шпатели, штативы, предметные и покровные стекла, красители, спиртовка.При любой микробиологической работе: при посевах, пересевах, выделении, сохранении чистых культур используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры. Посевы производятся в стерильных боксах.Для обработки посуды применяется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течении 2 часов, при температуре 170 0С в электросушильных шкафах.Вся посуда перед стерилизацией должна быть вымыта, высушена и завернута в бумагу. Для заворачивания посуды используют газетную бумагу (которая не размокает).Большинство питательных сред стерилизуют насыщенным паром под давлением в автоклавах. Повышение давления в автоклаве повышает температуру пара, образуемого внутри автоклава и, следовательно, температуру стерилизации (Теппер, 2004).Среды. В работе использованы полноценные питательные среды: МПА, МПБ. В качестве селективной среды использовалась среда М9 (состав см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также ПАА (НПАВ).3. Экспериментальная часть3.1 Культурально-морфологическая характеристика микроорганизмовВ работе использовалось 13 культур микроорганизмов. Культуральные и морфологические признаки исследуемых микроорганизмов представлены в таблице 1.Таблица 1. Культурально-морфологичесие признаки микроорганизмов
№ штамма
Признаки
Окраска по Граму
культуральные
морфологические
1
гладкая, светло-фиолетового цвета, полусухая, блеск слабый, полупрозрачная
мелкие, толстые палочки и споры
+
3
полупрозрачная, светло-фиолетового цвета, шершавая, с блеском, слизистая
толстые споровые палочки, прямые и изогнутые, одиночные, по 2, цепочками, с овальными концами
+
4
светло-фиолетового цвета, шершавая, с блеском, слизистая
толстые споровые палочки, одиночные, по 2, цепочками, с овальными концами
+
5
слизистая, гладкая, с блеском, сероватого цвета, выделяет черный пигмент
мелкие, споровые палочки, одиночные и по 2
+
14
молочного цвета, бугорчатая, с блеском, гладкая, слизистая
очень длинные споровые палочки, изогнутые, овальные концы
+
15
полупрозрачная, с блеском, шершавая, светло-фиолетового цвета, слизистая
короткие споровые палочки
+
17
светло-малинового цвета, гладкая, блестящая, полусухая
крупные палочки, неравномерно прокрашенные, фрагментированные палочки, споры
+
19
культура желтоватого цвета, слизистая консистенция, гладкая
серовато-бежевая колония, блестящая, прозрачная, точечный рост, слизистая консистенция, очень слабый
очень длинные палочки, неспоровые, прямые и изогнутые, с чехлами
+
с
кремового цвета, гладкая, слизистая, с блеском
кокки, разные
+
b
кремового цвета, бугорчатая, блестящая, слизистая
мелкие палочки, одиночные, по 2, слабо прокрашенные
+
а1
сероватого цвета, гладкая, слизистая, с блеском
мелкие, короткие палочки
+
а2
полупрозрачная, с блеском, ризоидная поверхность, слизистая
очень мелкие палочки, неярко прокрашенные
+
Из таблицы видно, что большинство из исследуемых микроорганизмов являются Г+ спорообразующими аэробными палочками, за исключением штаммов b, а1, а2 которые являются Г+ неспоровыми аэробными палочками.
Штамм «с» это Г+ кокки. Однако в более молодой культуре он был представлен Г+ палочками. Также можно отметить, что штамм 19 это грамвариабельные неспоровые палочки.
3.2 Физиолого-биохимическая характеристика микроорганизмовВ работе использовано 13 культур микроорганизмов. Были исследованы физиолого-биохимические свойства по 17 тестам. Результаты приведены в таблице 2.Таблица 2. Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов
№ штамма
1
3
хх
5
4
14
15
17
19
а1
а2
b
с
тест
утилизация глюкозы
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
утилизация фруктозы
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
-
утилизация маннозы
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
утилизация мальтозы
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
-
утилизация лактозы
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
утилизация трегалозы
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
-
утилизация маннита
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
наличие фосфатазы
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
наличие нитратредуктазы
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
-
-
образование ацетилметилкарбинола
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
-
наличие аргининдегидролазы
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
утилизация ксилозы
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
утилизация сахарозы
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
-
утилизация арабинозы
+
+
-+
-
-
+
+
+
+
-+
+
+
-
утилизация галактозы
+-
-
-+
-
-
+
-
-
+
-+
+
+
-
утилизация салицина
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
-
наличие уреазы
-+
-
+
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
Примечания: «+» - реакция положительная, «-» - реакция отрицательная, «-+», «+-» - цвет не полностью соответствует стандарту.Все исследованные штаммы микроорганизмов обладают фосфатазой, аргининдегидролаза обнаружена только у одного штамма (с), утилизируют маннозу все штаммы за исключением штамма с. Утилизирует ксилозу только штамм с. Утилизация лактоза не обнаружена ни у одного из исследованных штаммов.По итогам проведения микроскопических исследований можно предположить, что большинство из исследованных культур микроорганизмов относится к р. Bacillus.3.3 Определение активности микроорганизмов-деструкторов ПАВОпределение способности штаммов подвергать деградации различные ПАВ осуществляли с помощью метода лунок (Турковская, 1997).В ходе эксперимента установлено, что выделенные штаммы характеризуются большей активностью по отношению к НПАВ (оценка не менее 4). Менее интенсивный рост отмечался в экспериментах с АПАВ и КПАВ (оценки от 2 до 5). Несмотря на это, отмечаются штаммы, имеющие высокую активность (оценка 4,5) в каждом варианте эксперимента (1,4,15, а2, а1) (см. приложение 2).Таблица 3. Оценка активности штаммов-деструкторов ПАВ методом лунок
№ штамма
НПАВ
АПАВ
КПАВ
Оценка
1
5
4
5
3
5
4
3
4
5
4
5
5
5
4
3
14
4
5
3
15
5
4
5
17
5
5
3
19
4
-
-
а1
5
4
4
а2
5
4
5
b
5
4
4
с
5
2
3
хх
5
4
3
Примечание: 5 баллов - очень хороший рост; 4 балла - хороший рост; 3 балла - рост средней интенсивности; 2 - слабый рост.Микроорганизмы, характеризующиеся высокой активностью в присутствии ПАВ всех классов могут иметь большое значение в процессах очистки окружающей среды от загрязнения синтетическими моющими средствами. 3.4 Определение способности роста микроорганизмов на средах с добавлением различных ПАВОпределение способности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на питательном агаре (ПА) с добавлением СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также с добавлением ПАА (НПАВ) производилось чашечным методом. Учет результатов производился через 2 суток. Результаты приведены в таблице 4.Таблица 4. Результаты роста микроорганизмов на среде с различными ПАВ
№ штамма
Наличие роста, КОЕ/мл
КПАВ
АПАВ
НПАВ
1
-
+
+
3
-
+
+
4
-
+
+
5
+
+
+
14
-
+
+
15
-
+
+
17
-
+
+
19
-
+
+
хх
-
+
+
а1
+
+
+
а2
+
+
+
b
+
+
+
с
+
+
+
В ходе эксперимента рост микроорганизмов отмечался на средах с добавлением АПАВ и НПАВ. На среде с добавлением КПАВ только 5 штаммов обнаружили рост.При микроскопии было установлено, что штаммы микроорганизмов выросшие на среде с добавлением АПАВ не образуют спор. А также не пигментированы. Штаммы, выросшие на среде с добавлением НПАВ ничем не отличались от исходных культур. Штамм №5 на среде с добавлением КПАВ так же не образовывал спор, однако пигментация не изменилась (выделяет черный пигмент). Выводы1. В ходе работы исследовано 13 культур микроорганизмов. Все культуры способны расти на средах с добавлением НПАВ и АПАВ. В эксперименте с использованием КПАВ обнаружен рост только 5_ти культур (а1, а2, b, с, 5).2. Наибольшей активностью исследуемые штаммы обладают по отношению к НПАВ.3. Все исследуемые штаммы обладают фосфатазой, не утилизируют лактозу. Только штамм а2 обладает аргининдегидролазой. Большинство исследованных штаммов являются аэробными Г+ споровыми палочками. Это позволяет отнести их к роду Bacillus.Литература1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение. - 2 изд. - Л., 1981. - 330 с.2. Алексеева А.В. Коллоидная химия. - СПб: «Наука», 1998 - 290 с. 3. Аналитический обзор Комитета по природопользованию за 2005 год. / под ред. Голубева Д.В. и др. / - М.: «Сезам», 2006 - 25 с.4. Вербина Н.М. Деградация микроорганизмами неприродных органических соединений в окружающей среде. - М.: Микробиология, 1978. - т. 7.5. Глазовская М.А. Способность окружающей среды к самоочищению // Природа, 1979. - №3.6. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. - 232 с.7. Елинов М.Н. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. - М.: Медицина, 1998. - 190 с.8. Королев В.А. Очистка грунтов от загрязнений. - М.: МАИК Наука // Интерпериодика, 2001. - 365 с.9. Никитин Д.П., Новиков Ю.В. Окружающая среда и человек: Учеб. пособие для студентов вузов. - М.: Высш. школа, 1980. - 424 с.10. Новиков Ю.В. Экология, окружающая среда и человек: Учеб. пособие для вузов, средних школ и колледжей. - М.: Фаир-пресс, 2002. - 560 с.11. Поликарпов Н. Действие ПАГов на микро- и макроорганизмы. Аналитический обзор. 2005 г.12. Ротмистров М.Н., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. - К.: Наук. думка, 1978 г. - 268 с.13. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей р. Pseudomonas. - М.: Наука, 1986 г. - 352 с.14. Савицкая М.Н., Холодова Ю.Д. Полиакриламид. - Киев: Техника, 1969. -188 с.15. Ставская С.С. Биологическое разрушение АПАВ. - К.: Наук. думка, 1981 г. - 116 с.16. Таубман А.Б., Маркина 3. H. Коллоидные поверхностно-активные вещества. / пер. с англ. / - M. - 1966 г. - 199 с.17. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии / Шильникова В.К., Переверзева Г.И. - М.: Агропромиздат, 2004. - 233 с.18. Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов: Авт. дис. д.б.н. - Саратов, 2000. - 360 с.19. Успехи коллоидной химии / под ред. И.В. Петрянова-Соколова, К.С. Ахмедова. - Ташкент, 1987.20. Хотько Н.И., Дмитриев А.П. Водный фактор в передаче инфекций. / Материалы странички ПАВ. - М. - 2006 г.21. Яковлев С.В. и др. Охрана окружающей среды: Учебник / С.В. Яковлев и др. - М.: Изд-во АСВ, 1998. - 180 с.22. ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического исследования. - М.:Изд-во стандартов, 1981. - 6 с.23. www.aquaria.com.ua/coretra.html24. www.ecocoop.ruПриложениеСреда М9 (г/л):Na2HPO3 - 6,0KH2PO4 - 3,0NaCl - 0,5NH4Cl - 1,0НПАВ - 0,2-1,0рН - 7,0-7,2Питательный агар (ПА) (г/л):Панкреатический гидролизат рыбной муки - 24Агар-агар - 12-14NaCl - 4Дистиллированная вода - 1 лрН среды 7,3 - 7,5Способ приготовления38,0 г порошка размешать в 1 л дистиллированной воды, кипятить 2 мин. До полного расплавления агара, фильтровать через ватно - марлевый фильтр, разлить в стерильные флаконы и стерилизовать при температуре 121 °С в течение 15 мин.Среду охладить до температуры 45-50 °С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37-38 °С в течение 40-60 мин (Теппер, 2004).
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
