ельзя, однако, исключить и иное объяснение: давление влияет на фермент прямо, а не опосредованно через липид. Впрочем, эти эксперименты важны уже тем, что показывают возможность изменения физического состояния мембраны под действием гидростатического давления.4.5 Переносчик глюкозыПоразителен, однако, тот факт, что на максимальную скорость работы этого переносчика вообще не влияет температурный фазовый переход липида из жидкокристаллического состояния в гель. 5. Мембраносвязанные электротранспортные цепиВ большинстве работ, посвященных мембранным ферментам, исследовались компоненты различных мембранных систем электронного транспорта. Эти системы выполняют весьма важные биохимические функции, а их компоненты содержат окрашенные простетические группы, что позволяет следить с помощью спектрофотометрического метода за кинетикой их редокс- или конформационных превращений как в нативной мембране, так и после выделения и очистки отдельных ферментов. Здесь мы рассмотрим четыре основные злектронтранспортные системы, схематически изображенные на рис. 5. Это:1) участвующая в биосинтезе стероидов, содержащая цитохром Р450 система митохондрий коры надпочечников;2) система микросомного окисления, включающая множество цитохромов Р450, а также цитохром bs \ 3) дыхательная цепь митохондрий;4) фотосинтетическая система тилакоидов зеленых растений. Все четыре системы являются основными белковыми компонентами мембран, в которых они локализованы, и могут служить иллюстрацией различных уровней организации мультиферментных комплексов в мембранной энзимологии. Первые две системы катализируют анаболические и катаболические реакции, протекающие в присутствии молекулярного кислорода и обычно липофильных мембраносвязанных субстратов. Терминальные ферменты этих электронтранспортных цепей, цитохром Р450 и десатураза жирных кислот, характеризуются очень низким числом оборотов. Системы и являются основными электронтранспортными ансамблями энергетического обмена, первичная функция которых состоит в переносе протонов через мембрану. Генерируемый при этом градиент электрохимического потенциала протонов используется для синтеза АТР. В отличие от микросомной и митохондриальной систем цитохрома Р450, дыхательная и фотосинтетическая цепи катализируют трансмембранные реакции и характеризуются довольно высоким числом оборотов, 200-300 с " 1. В приведенном ниже кратком обзоре основное внимание обращается на частные вопросы, интересные с точки зрения энзимологии, отмечаются некоторые общие черты, а также представляющие особый интерес дискуссионные моменты.При рассмотрении любой из этих систем, естественно, возникает вопрос: до какой степени могут взаимодействовать друг с другом различные мембраносвязанные компоненты этих электронтранспортных цепей, с тем чтобы образовались долгоживущие комплексы? Теоретическое рассмотрение вероятности ассоциации мембранных белков показывает, что наиболее важны следующие факторы:1) высокая концентрация реакционноспособных белков из-за ограниченности мембранного пространства;2) заранее заданная ориентация белков, поскольку они могут вращаться лишь в плоскости, параллельной плоскости мембраны; вращение перпендикулярно поверхности бислоя запрещено;3) исключенный объем, связанный с наличием в мембране других белков, что приводит к еще большему концентрированию компонентов этих систем.5.1. Система синтеза стероидов в митохондрияхВыделяемые надпочечниками стероидные гормоны, такие, как кортизон, синтезируются из холестерола в ходе реакций, катализируемых ферментами, которые локализованы в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. При этом промежуточные продукты метаболического пути должны "курсировать" между данными органеллами. Реакции катализируются мембраносвязанными гемсодержащими белками - цитохромами Р450. Название этой большой группы ферментов связано с тем, что максимум их поглощения приходится на длину волны 450 нм. Эти ферменты являются оксидазами со смешанной функцией; в катализируемой ими реакции происходит расщепление молекулы кислорода, при этом один атом кислорода включается в состав молекулы воды, второй - в субстрат. В биосинтезе стероидов участвуют четыре цитохрома Р450. Два находятся в митохондриях, два - в эндоплазматическом ретикулуме ткани. Необходимые для реакции электроны поступают в систему через относительно простую электронтранспортную цепь.В митохондриях коры надпочечников источником электронов для синтеза гормонов является NADPH, который восстанавливает флавопротеин и ферредоксин. Эти белки локализованы на матриксной стороне внутренней митохондриальной мембраны. Два цитохрома Р450, P450scc и Р450п#, являются интегральными мембранными ферментами, способными взаимодействовать с мембраносвязанными субстратами. Адренодоксин-редуктаза, возможно, частично погружена в бислой, но легко отделяется от мембраны. Адренодоксин - это низкомолекулярный рао" творимый белок, он переносит электроны от флавопротеи" на к цитохромам Р450. Взаимодействие адренодоксина с редуктазой и цитохромами Р450 осуществляется главным образом с помощью ионных взаимодействий. Вероятно, с обоими реакционными партнерами адренодоксин связывается с помощью одного и того же домена. Такой же способ передачи электронов между двумя мембранными ферментами при участии небольшого растворимого белка можно обнаружить и в дыхательной, и в фотосинтетической электронтранспортных системах. Связывание стероидных субстратов с цитохромами Р450 можно зарегистрировать по изменениям в спектре поглощения гема. Холе-стеролсвязывающий центр, по-видимому, экспонирован в гидрофобную область липидного бислоя. Показано также, что связывание холестерола более чем в 10 раз увеличивает сродство адренодоксина к цитохрому Р450.Число оборотов адренодоксина гораздо выше, чем двух указанных ферментов, поэтому одна молекула восстановленного адренодоксина может обеспечить электронами несколько молекул цитохрома Р450. Указанная на Рис.6.5 стехиометрия компонентов при условии, что лимитирующим является функционирование цитохромов Р450, создает своеобразный эффект электронного каскада. Очевидно, что при таких обстоятельствах три компонента этой простой системы не смогут образовать единый суперкомплекс, да и вряд ли формирование такого комплекса способствовало бы эффективному переносу электронов по цепи.5.2 Микросомные электронтранспортные цепиЭлектронтранспортные цепи, локализованные на цитоплазматической поверхности эндоплазматического ретикулума, участвуют также в метаболических превращениях липофильных субстратов. Как видно из Рис.6.5, существуют две такие системы, но, как недавно выяснилось, они не являются независимыми. В одной системе NADH окисляется флавопротеином цитохром fts-редуктазой, которая в свою очередь через цитохромы восстанавливает стеарил-СоА-десатуразу. В микросомах печени десатураза является индуцибельным ферментом. Вторая система включает в себя окисление NADPH другим флавопротеином, цитохром Р450-редуктаз<цй, которая затем передает электроны на целое семейство цитохромов Р450. Одни из этих цитохромов также являются индуцибельными, другие - конститутивными. Отметим, что в обеих системах число терминальных ферментов значительно превышает число редуктаз в начале каждой цепи. Как и в Р450-содержащей системе митохондрий, число оборотов терминальных ферментов настолько мало, что небольшое число редуктаз вполне успевает обеспечить восстановительными эквивалентами все молекулы терминальных ферментов. Микросомная система не содержит каких-либо растворимых белковых компонентов, аналогичных адренодоксину; все ферменты представляют собой интегральные мембранные белки, их можно выделить из мембраны, очистить и исследовать в реконструированном виде.В серии обстоятельных работ Штритматтер с коллегами четко показал, что цитохром />5-редуктаза и цитохром bs распределены в мембране случайным образом и взаимодействуют благодаря диффузии: эти два фермента диффундируют латерально по поверхности мембраны, а перенос электронов происходит только во время их случайных столкновений. Такой механизм реализуется как в реконструированных протеолипосомах, так и в микросомной мембране. Диффузия, однако, не является лимитирующим процессом. В норме в системе имеется десятикратный избыток цитохрома bs над редуктазой. Такой избыток связанного с мик-Росомной мембраной экзогенного цитохрома bs кинетически эквивалентен эндогенному пулу цитохромов bs. И цитохром bs, и цитохром 65-редуктаза являются двухдоменными белками, в которых глобулярный растворимый домен связывает простетическую группу, а единственный гидрофобный хвост заякоривает белок в мембране. Гемсвязывающий и флавинсвязывающий домены сконструированы таким образом, чтобы облегчить перенос электрона от флавина к гему при взаимодействии этих белков.В более поздних исследованиях, однако, были получены серьезные указания на то, что часть цитохрома bs в микросомах не диффундирует свободно, а по крайней мере временно образует стехиометрические комплексы с цитохромами Р450 и, возможно, с NADPH-цитохром Р450-редуктазой. Таким образом, цитохром bs играет важную роль в работе электронтранспортной цепи, включающей по крайней мере некоторые изоформы цитохрома Р450 из микросом печени.Различные цитохромы Р450 в микросомах печени окисляются целым рядом эндогенных липофильных субстратов, а также чужеродных молекул. Если исходить из первичной структуры изоформ цитохромов Р450, то эти белки должны иметь множество трансмембранных сегментов, однако экспериментальные исследования показывают, что, по-видимому, ферменты заякорены в микросомной мембране с помощью единственного трансмембранного спирального домена, расположенного ближе к N-концу полипептида. NADPH-цитохром Р450-редуктаза имеет близкую структуру с большим гидрофильным доменом, прикрепленным к мембране коротким гидрофобным хвостом. Чтобы объяснить, каким образом одна молекула редуктазы может "обслужить" столь большой избыток молекул Р450, предложено два механизма. В одном постулируется существование стабильного кластера, представляющего собой молекулу редуктазы в окружении молекул цитохромов Р450. Согласно второй модели, для переноса электронов необходимы свободная диффузия и столкновение ферментов. Получены некоторые данные о формировании в реконструированных фосфолипидных протеолипосомах эквимолярных комплексов цитохрома Р450 и его редуктазы. Если такие комплексы действительно существуют в микросомной мембране, то они, по-видимому, представляют собой временные образования, быстро распадающиеся и вновь образующиеся с участием других молекул Р450. Лишь в таком варианте единственная молекула редуктазы может восстановить много молекул цитохромов. Окончательную картину еще предстоит выяснить, но уже ясно, что компоненты микросомной цепи нельзя считать изолированными. Для успешного функционирования системы, вероятно, существенными могут оказаться какие-то сложные варианты белок-белковых взаимодействий.5.3 Дыхательная система митохондрийВнутренняя мембрана митохондрий является местом, где осуществляется окислительное фосфорилирование. Суть процесса состоит в сопряжении потока электронов, направленного от органических субстратов к кислороду, с перемещением протонов из матрикса митохондрий через мембрану в межмембранное пространство. Как и предыдущие две электронтранспортные цепи, компоненты этой системы тоже представлены не в эквимолярных количествах, т.е. дыхательная цепь не может функционировать как долгоживущий мультиферментный комплекс. Однако в данном случае число оборотов терминального фермента, цитохром с-оксидазы, весьма велико, а оценить, какая стадия является лимитирующей, в такой ситуации очень непросто. Цепь состоит из четырех трансмембранных мультисубъединичных комплексов, растворимого цитохрома с и убихинона-10. Перенос электронов через комплекс II не сопровождается переносом протонов. Однако реакции, катализируемые комплексом I, комплексом III и комплексом IV, сопровождаются векторным переносом протонов через мембрану. Эти реакции являются электрогенными и приводят к генерации трансмембранного электрического потенциала. Такие ферменты в составе цепи называются "местами сопряжения". Относительно механизмов перемещения протонов пока нет единого мнения, хотя в литературе обсуждаются конкретные модели, в частности для комплексов III и IV. Образующаяся трансмембранная разность электрохимических потенциалов протонов уменьшается за счет работы протонного канала АТР-синтазы. Энергия потока используется этим ферментом для синтеза АТР.Концентрация компонентов дыхательных цепей в митохондриальной мембране довольно высока, однако существование эквимолярных комплексов между образующими эти цепи мультисубъединичными ферментами нельзя считать доказанным.В литературе обсуждаются модели электронного транспорта с участием таких переходных долгоживущих белковых агрегатов, однако имеющиеся кинетические данные можно объяснить, не предполагая образование таких суперкомплексов. Цитохром с выполняет функцию челнока, быстро переносящего электроны между комплексами III и IV, аналогично адренодоксину в содержащей цитохром Р450 системе митохондрий. При физиологической ионной силе цитохром с может диффундировать не только вдоль поверхности бислоя, но и в объеме раствора, что увеличивает его способность к быстрому переносу электронов. Данная система обладает рядом особенностей, не характерных для описанных выше примеров электронтранспортных цепей.Основные компоненты дыхательной цепи организованы в не-диссоциирующие комплексы. Например, комплекс III состоит из нескольких субъединиц и содержит три гема и один железосерный центр. Перенос электронов между простетическими группами внутри каждого из компонентов происходит быстро и не требует их случайных столкновений.Жирорастворимые переносчики водорода служат для переноса восстановительных эквивалентов не только между ферментами, но и с одной стороны бислоя на другую. Показано, что убихинон обладает способностью к быстрой латеральной диффузии в плоскости мембраны, хотя вопрос о величине коэффициента диффузии не решен. В модельных системах убихинон также может переносить восстановительные эквиваленты через бислой. Убихинон при перемещениях не выходит из мембраны, однако в ходе редокспревращений он может захватывать или высвобождать протоны на границе раздела фаз липид-вода с любой стороны мембраны. Кинетические свойства изолированных ферментов, использующих убихинон в качестве субстрата, можно с успехом анализировать, используя уравнения Михаэлиса-Ментен с соответствующими значениями Км и Итах, если известна реальная концентрация хинона в бислое. Иное дело, если мы рассматриваем стационарную кинетику систем, в которых одна популяция ферментов сопряжена с другой посредством свободно диффундирующего пула хинонов как интермедиатов. Для описания подобных систем приходится применять специальные уравнения. Тот факт, что компоненты дыхательной цепи связаны через свободно диффундирующий пул хинонов, не вызывает сомнений, но в вопросе, является ли диффузия хинона лимитирующей стадией в работе электронтранспортной цепи, единого мнения среди исследователей нет.Протоны, перенесенные через мембрану при работе дыхатель- ной цепи, возвращаются обратно с помощью АТР-синтазы, замыкая тем самым протонный цикл. Механизм, по которому протоны переносятся от компонентов электронтранспонтной цепи к АТР-синтазе, тоже до конца не установлен, и этот вопрос вряд ли будет разрешен в ближайшем будущем. Большинство исследователей считают, что протоны, переносимые через бислой, быстро приходят в равновесие со всей водной фазой. Согласно другой точке зрения, существует локализованный протонный поток и протоны переносятся либо вдоль поверхности бислоя, либо внутри бислоя, либо прямо на АТР-синтазу. Большинство данных в пользу этого механизма носят косвенный характер, но в литературе имеются свидетельства быстрого перемещения протонов вдоль поверхности фосфолипидного монослоя в нефизиологических условиях. Возможно, при некоторых обстоятельствах такой локализованный протонный поток имеет какое-то значение.Таким образом, данная электронтранспортная система представляет собой совокупность небольшого числа высокоорганизованных комплексов, связанных между собой низкомолекулярными подвижными переносчиками, как липофильными, так и водорастворимыми. Кинетику переноса электронов можно объяснить в рамках модели свободно диффундирующих форм, которые могут перемещаться вдоль мембраны на расстояние более 100 А.5.4. Фотосинтетическая электронтранспортная система тилакоидовК фотосинтетической электронтранспортной системе можно также отнести светособирающие комплексы, поглощающие свет и передающие энергию электронного возбуждения на два реакционных центра. Захват энергии возбуждения реакционными центрами приводит к разделению зарядов и образованию на противоположных сторонах мембраны сильного окислителя и сильного восстановителя. Это в свою очередь Ведет к окислению воды до молекулярного кислорода фотосистемой II и создает движущую силу для транспорта электронов по цепи, сопряженного с трансмембранным переносом протонов. Образующийся на бислое градиент электрохимических потенциалов протонов используется для синтеза АТР с помощью АТР-синтазы, называемой сопрягающим фактором. Структура фотосистемы II, по-видимому, очень похожа на структуру бактериального фотореакционного центра, которая была детально изучена методом рентгеноструктурного анализа. &б/-Комплекс аналогичен комплексу III дыхательной цепи митохондрий, а сопрягающий фактор - митохондриальной АТР-синтазе. Роль пластоцианина очень напоминает роль цитохрома с в дыхательной цепи, являющегося растворимым переносчиком электронов, а пластохинон представляет собой полный аналог убихинона в электронтранспортной системе митохондрий.В отличие от дыхательной цепи основные мембранные комплексы представлены в фотосинтетической системе примерно в эквимо-лярном соотношении. Однако какие-либо серьезные указания в литературе на формирование суперкомплексов отсутствуют. Напротив, для данной системы характерна поразительная латеральная гетерогенность, в результате которой фотосистема II оказывается локализованной в гранальных, плотно упакованных участках, а фотосистема I и сопрягающий фактор - в стромальных участках тилакоида. Пластохинон и комплекс, по-видимому, распределены между этими участками равномерно. Вследствие такого латерального разделения для сопряжения двух фотосистем необходима диффузия на расстояние по крайней мере 1000 А. Скорее всего основным переносчиком восстановительных эквивалентов на такие расстояния является пластохинон, хотя скорость его латериальной диффузии точно не известна. В оптимальных условиях лимитирующей стадией, вероятно, является окисление пластохинона Јб/-комплексом, однако связано ли это со скоростью его латеральной диффузии или с работой самого фермента - неясно.Латеральное разделение компонентов цепи в тилакоидах явно не способствует ускорению переноса электронов между ферментами. Возможно, оно необходимо для эффективного перераспределения световой энергии между двумя фотосистемами. Фосфорилирование белка светособирающего комплекса II приводит к его перераспределению между гранальными и стромальными участками мембраны, облегчая его взаимодействие с фотосистемой I в стромальных участках, что в свою очередь увеличивает долю энергии возбуждения, поступающей на реакционные центры фотосистемы I.5.5 Взаимодействия между мембранными и растворимыми ферментамиБиомембраны играют важную роль в функционировании целого ряда растворимых ферментов. После разрушения клетки многие ферменты можно обнаружить и в растворимой, и в мембранной фракциях. Отнесение некоего фермента к классу периферических мембранных белков зависит от силы его взаимодействия с мембраной и способа выделения. Кроме того, некоторые растворимые ферменты в специфических условиях связываются с мембраной, и, следовательно, в зависимости от физиологического состояния клетки локализуются либо на мембране, либо в цитозоле. Кроме того, существует группа растворимых ферментов, катализирующих реакции с участием мембраносвязанных субстратов. Для функционирования такие белки должны быть способны хотя бы временно связываться с мембраной.Во всех этих случаях мембрана выполняет следующие функции:1) определяет локализацию или компартментацию фермента или группы ферментов;2) осуществляет аллостерическую активацию или инактивацию ферментов в определенных условиях или в определенной области в клетке;3) создает среду, в которой липофильные субстраты могут быть превращены в соответствующие продукты. 6. Растворимые ферменты, которые при необходимости могут связываться с мембранойПока эта важная группа насчитывает небольшое число ферментов, но, по-видимому, в недалеком будущем их список увеличится. Наиболее характерный пример - протеинкиназа С, хотя и другие представители этой группы неплохо охарактеризованы.6.1 Протеинкиназа СЭто ключевой фермент системы передачи сигнала, запускаемого быстрым расщеплением фосфатидилинозитолов в плазматической мембране. Такие внеклеточные вещества, как нейромедиаторы, гормоны или факторы роста, связываются со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Это приводит к активации фосфолипазы С, которая начинает гидролизовать фосфатидилинозитолы с образованием вторых посредников. Один из продуктов гидролиза, инозитол-1,4,5-трифосфат, вызывает увеличение концентрации свободного кальция внутри клетки. Второй продукт, 5я-1,2-диацилглицерол, активирует протеинкиназу С, что в свою очередь приводит к фосфорилированию целого ряда белков-мишеней, многие из которых, например рецептор фактора роста эпидермиса, являются мембраносвязанными. Согласно современным представлениям, данная система участвует в осуществлении целого ряда клеточных функций, в частности в делении, дифференцировке и экзоцитозе.До активации клетки какими-либо экзогенными агентами протеинкиназа С остается неактивной и обнаруживается только в цитозоле. Однако после стимуляции клетки фермент быстро активируется и оказывается в мембранных фракциях. Исследования in vitro показали, что для связывания с мембраной и активации необходимы кислые фосфолипиды, а также Са2 + и диацилглицерол. Специфичность к фосфолипиду, необходимому для активации, до некоторой степени зависит от природы субстрата. Для активации фосфотрансферазной активности фермента можно добавить прямо к клеткам проникающие через мембрану коротко цепочечные диацилглицеролы, например диоктаноилглицерол. Природные вторые посредники, длинноцепочечные диацилглицеролы, нерастворимы в воде и остаются в мембране. Аналогичное действие оказывают, по-видимому, промоторы опухолевого роста форболовые эфиры: как показано, они способны связываться с ферментом и вызывать те же изменения, что и эндогенный сигнал. После связывания форболовых эфиров или диацилглицеролов возрастает сродство фермента к Са2+ и фосфатидилсерину. Показано, что эффективным конкурентным ингибитором фермента является сфингозин.На самом деле протеинкиназа С представлена несколькими разными, но близкими по структуре полипептидами с мол. массой - 80000. Например, из мозга кролика выделено три формы. Протеинкиназа С имеет двухдоменную структуру. Один домен содержит каталитические центры, связывающие АТР и белок-субстрат, и функционирует как сериновая и треониновая фосфотрансфераза. Второй домен, по-видимому, участвует в связывании фосфатидилсерина, диацилглицерола и Са2 +. С помощью мягкого протеолиза можно разделить два этих домена, получив полностью активный каталитический фрагмент с мол. массой - 50000. Таким образом, активировать фермент можно двумя взаимоисключающими способами: протеолизом и связыванием с мембраной. Таким же образом ведут себя и некоторые другие липидзависимые ферменты, например пируватоксидаза. Физиологическое значение протеолитической активации неясно.Очищенный фермент был встроен в фосфолипидные везикулы и в смешанные везикулы, содержащие тритон Х-100 и фосфолипиды. В обоих случаях было показано, что само по себе связывание липида ферментом необходимо, но не достаточно для проявления ферментативной активности. Например, для связывания фермента с фосфолипидными везикулами достаточно 2 "Уо фосфатидилсерина, в то время как для оптимального фосфорилирования его необходимо уже 50. В норме содержание фосфати-дилсерина в плазматической мембране составляет 8-10%. Поскольку фермент активируется в смешанных мицеллах, содержащих примерно 20 мол. % фосфатидилсерина в тритоне Х-100, наличие бислойной структуры не является необходимым, что, вообще говоря, весьма типично для липидзависимых ферментов. Зависимость наблюдаемой активации от концентрации фосфатидилсерина свидетельствует о кооперативном характере взаимодействий фермента и липида, что также довольно обычно. По оценкам функционально активный фермент представляет собой комплекс, содержащий мономер фермента, одну молекулу диацилглицерола, один или более ионов Са2+ и по крайней мере четыре молекулы фосфатидилсерина. Связывание всегда происходит с поверхностью мембраны, но роль Са2+ неизвестна. Он может, например, хелатировать карбоксильные группы фосфатидилсерина и какие-то группы в белке и/или играть роль аллостерического регулятора при связывании белка. Тот факт, что фермент может быть помечен иодонафталин-1-азидом, служит указанием на некоторое проникновение белка в гидрофобную зону бислоя, но не более того.6.2 Эффект поверхностного разведения в смешанных мицеллахРис. иллюстрирует интересную особенность протеинкиназы С и других мембранных ферментов, выявляемую при измерении их активности в системах со смешанными мицеллами. В этом эксперименте измеряли зависимость способности фермента связывать форболовый эфир от концентрации тритона Х-100. Если поддерживать постоянным содержание фосфатидилсерина в мольных процентах, а концентрацию тритона Х-100 увеличивать, то фермент будет связывать форболовый эфир даже при высокой концентрации детергента. Однако если поддерживать постоянной объемную концентрацию фосфолипида и увеличивать количество детергента, то фермент перестанет связывать форболовый эфир при высоких концентрациях тритона Х-100. Для активации фермента важна не объемная, а поверхностная концентрация липида, иными словами, число молекул липида на мицеллу. Если эта величина падает, то уменьшаются также способность фермента связываться с такими смешанными мицеллами и способность активироваться. Это явление называется явлением поверхностного разведения.6.3 Другие примерыЛимитирующей стадией биосинтеза фосфатидилхолина является синтез интермедиата CDP-холина. Фермент, катализирующий эту реакцию, называется СОР: фосфохолин цитидилтрансферазой. Он содержится в цитозоле, но, как было недавно показано, может связываться с эндоплазматическим ретикулумом, где происходит его активация. Именно в месте связывания осуществляется биосинтез фосфатидилхолина. Отметим, что оба субстрата растворимы в воде и не связаны с мембраной. Что заставляет фермент связываться с мембраной, пока неясно. Возможно, сигналом служит появление в мембране диацилглицеролов. Рассматриваются также следующие механизмы:1) увеличение содержания длинноцепочечных жирных кислот или ацильных производных СоА;2) истощение микросомной мембраны по фосфатидилхолину;3) дефосфорилирование самого фермента, в результате чего он переходит в мембраносвязанную активную конформацию. Для установления истинного механизма необходимы дальнейшие исследования.Показано, что в зависимости от содержания мембраносвязанных диацилглицеролов фермент диацилглицеролкиназа может перемещаться из цитозоля в мембрану. Он катализирует превращение диацилглицерола в фосфатидную кислоту и по крайней мере частично ответствен за утилизацию диацилглицерола в мембране. Диацилглицерол и жирные кислоты участвуют также в связывании а-актинина с мембранами. Полагают, что определенную роль в прикреплении пучков микрофиламентов к плазматической мембране играет и диацилглицеролкиназа. Возможно, индуцируемое диацилглицеролом и жирными кислотами образование комплексов а-актинина и актина является важным элементом физиологической активности тромбоцитов.Остановимся вкратце еще на двух ферментах, которые в определенных условиях связываются с биомембранами: пируватоксидазе и фосфатидилсеринсинтетазе из Е. coli. В присутствии субстрата оба фермента перемещаются из цитозоля в цитоплазматическую мембрану. Пируватоксидаза уже упоминалась как пример липидзависимого фермента. В присутствии пирувата, восстанавливающего связанный с белком флавиновый кофактор, фермент по своим свойствам становится классическим мембранным белком. Он восстанавливает растворенный в мембране убихинон и поэтому для своего функционирования должен быть связан с мембраной. В норме при очистке фосфатидилсеринсинтазы она выделяется в связанном с рибосомами виде, но в присутствии либо субстрата, либо продукта оказывается связанной с мембраной.6.4 Растворимые ферменты или ферментные ансамбли, которые in vivo могут быть ассоциированы с мембранойВ литературе все чаще появляются данные о возможной ассоциации целого ряда растворимых ферментов с мембраной. Большинство работ посвящено связыванию ферментов цикла трикарбоновых кислот и /3-окисления жирных кислот с внутренней митохондриальной мембраной и ферментов гликолиза с плазматической мембраной эритроцитов. Приводятся доказательства, хотя и не вполне убедительные, что ферменты митохондриального матрикса организованы в связанные с поверхностью мембраны мультиферментные комплексы. В некоторых случаях удалось выявить специфические центры связывания. Например, NAD + - зависимые дегидрогеназы образуют комплексы с NADH: убихинон оксидоредуктазой. Креатинфосфокиназа специфически связывается с кардиолипином во внутренней митохондриальной мембране; гексокиназа также связывается с митохондриями - возможно, с их наружной мембраной. Распределение гексокиназы между растворенной и связанной с митохондриями формами, по-видимому, модулируется гормонами или метаболитами. Во всех этих случаях смысл ассоциации перечисленных ферментов, а возможно, и других растворимых ферментов с мембраной, состоит в "канализации" субстрата. Например, переносимый через внутреннюю митохондриальную мембрану АТР должен более эффективно утилизироваться гексокиназой, локализованной около мембраны. Однако это предположение пока нельзя считать окончательно доказанным.В ряде работ показано, что гликолитические ферменты связываются с экспонированным в цитоплазму кислым доменом белка полосы 3 мембраны эритроцитов. В число этих ферментов входят альдолаза, фосфофруктокиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. Предполагается, что в некоторых случаях связанный с мембраной фермент может оставаться в неактивной форме и быстро переходить в активную цитоплазматическую форму в присутствии соответствующих метаболитов. Пока неясно, правда, происходит ли такая ассоциация in vivo или это артефакт, связанный с работой in vitro. Взаимодействия между белками в таких ассоциатах относительно слабые и зависят от ионной силы. Такая же картина характерна для некоторых предполагаемых ассоциатов ферментов с митохондриальной мембраной. Однако сопряжение гликолитических функций с мембранными активностями и компартментализация этих ферментов, вообще говоря, слишком привлекательная концепция, чтобы ее отбрасывать, тем более что для других систем существование таких ассоциатов доказано.Получить убедительные доказательства физиологической значимости взаимодействия этих ферментов и ферментных ансамблей с мембраной довольно трудно, но есть основания полагать, что в недалеком будущем в этой области исследований будет достигнут определенный прогресс.Еще один класс взаимодействующих с мембраной растворимых белков представляют цитотоксины.6.5 Факторы свертывания крови - внеклеточные ферменты, активируемые связыванием с мембранойСвертывание крови происходит в результате сложного каскада реакций с участием целого ряда факторов сыворотки. В ходе этих реакций осуществляется последовательная протеолитическая активация серии зимогенов, каждый из которых, активировавшись, в свою очередь вызывает активацию одного или нескольких других зимогенов. Конечным результатом всех этих реакций является превращение фибриногена в фибрин. Для осуществления многих этапов этого каскада необходимо, чтобы активированная протеаза и/или субстрат-зимоген связалась с мембраной тромбоцитов, эндотелиальных или иных клеток. Особый интерес представляют следующие вопросы:1) как белки связываются с мембранами? 2) какую роль играет мембрана в активации участвующих в свертывании крови ферментов? Окончательных ответов на эти вопросы пока нет.Всем связывающимся с мембранами факторам свертывания крови необходимы кислые фосфолипиды. Некоторые из них, в частности факторы VII, IX, X и протромбин, требуют также Са2+. С участием витамина К происходит модификация этих четырех белков - карбоксилирование в ^-положении остатков глутамата, локализованных в гомологичных N-концевых участках каждого из полипептидов. В результате такой модификации в молекуле белка формируется значительное число высокоаффинных центров связывания Са2 +, который в свою очередь необходим для соответствующего взаимодействия белков с кислыми фосфолипидами на мембране. Каким образом Са2+ облегчает белково-мембранные взаимодействия, не совсем ясно. Это может быть, в частности, "сшивание" с помощью Са2+ белка с гидрофильными отрицательно заряженными головками фосфолипида. Кальций необходим не для всех факторов свертывания крови. Так, фактор V может непосредственно взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфолипидами, а другой компонент, так называемый "тканевый фактор", вообще является интегральным мембранным белком. Большей частью, однако, факторы взаимодействуют с поверхностью бислоя за счет электростатических сил, хотя иногда наблюдается и некоторое проникновение белка в гидрофобную область мембраны.Присутствие фосфолипидов сильно меняет стационарную кинетику реакций протеолитической активации. Резко уменьшается значение Км для белкового субстрата; например, для реакции активации фактора X фактором 1Ха Км изменяется от 181 до 0,058 мкМ. Добавление другого белка, фактора Villa, увеличивает Kma* более чем в 200 000 раз. Поскольку реакция катализируется обоими ферментами, а субстрат в данных условиях измерения представлен как мембраносвязанной, так и свободной формами, истинный механизм влияния липида в таких реакциях определить чрезвычайно сложно. Например, показано, что протеолитическая активность фактора X увеличивается при связывании его с мембраной, в то время как фактор IX одинаково активен в свободном и в мембраносвязанном состояниях. Фактор X можно также активировать комплексом фактора Vila и тканевого фактора. В этом случае протеолитическая активация фактора X происходит, только когда он находится в свободной форме в растворе и не связан с мембраной. Другой пример - активация протромбина фактором Ха. Наблюдаемое в этом случае низкое значение Км коррелирует с концентрацией субстрата и протромбина на поверхности фосфолипидной везикулы. Если же добавить кофактор - фактор Va, образующий с фактором Ха комплекс, - то всякая зависимость Км от поверхностной концентрации протромбина на везикуле исчезнет. В заключение отметим, что данная система очень сложна, и роль липидов здесь отнюдь не сводится лишь к созданию соответствующей поверхности, на которой происходит простое концентрирование компонентов системы.Факторы свертывания крови входят в группу Са2 +-зависимых липидсвязывающих белков. Функции этих белков не всегда бывают известны; некоторые из них связаны с цитоскелетом. Фосфолипазы, к рассмотрению которых мы сейчас перейдем, также являются Са2 +-зависимыми ферментами.6.6 Фосфолипазы - растворимые ферменты, катализирующие расщепление мембраносвязанных субстратовФосфолипиды служат субстратами многих растворимых ферментов, в том числе фосфолипаз. Среди них лучше всего изучена фосфолипаза Аг, которая катализирует гидролиз фосфолипидов по положению sn-2 с образованием жирной кислоты и лизофосфолипида. Фосфолипаза Аг была выделена сначала из ядов кобры и гремучей змеи, а затем из поджелудочной железы быка и свиньи. Это очень близкие по первичной структуре небольшие белки с мол. массой около 14 000. Для некоторых ферментов удалось получить с высоким разрешением трехмерные структуры, также обладающие высокой степенью гомологии. Ферменты из поджелудочной железы синтезируются как неактивные зимогены, которые затем активируются протеолизом: от зимогена отщепляется семь остатков с С-конца.Фосфолипаза Аг представляет особый интерес с точки зрения мембранной энзимологии, поскольку она обладает способностью активироваться при взаимодействии с интегрированными формами субстрата, например с мицеллами или бислоем. На Рис.6.8 представлена зависимость от концентрации субстрата скорости гидролиза короткоцепочечного фосфатидилхолина фосфолипазой Аг и его предшественником из поджелудочной железы свиньи. Данный субстрат в концентрациях до 1,5 мМ является мономером, но при дальнейшем увеличении концентрации формирует мицеллы. И зимоген, и активированный фермент очень медленно гидролизуют субстрат в мономерной форме, но как только фосфолипид начинает образовывать мицеллы, активность фосфолипазы А2 резко возрастает.Активации фосфолипазы агрегированными субстратами было посвящено множество работ, а которых исследовалась кинетика катализируемого ферментом гидролиза субстратов в мономерной форме, в чистых липидных мицеллах, в смешанных мицеллах с тритоном Х-100, в монослоях на поверхности раздела воздух-вода и в фосфолипидных везикулах. Для проявления каталитической активности ферменту во всех случаях нужен Са2 +, причем центр связывания единственного иона Са2+ можно выявить с помощью рентгеноструктурного анализа. В отличие от факторов свертывания крови фосфолипаза Аг не содержит остатка - у-карбоксиглутаминовой кислоты и для ее активации не требуются кислые фосфолипиды.Для объяснения механизма активации фосфолипаз предложено несколько гипотезВ ряде работ было показано, что связывание фермента с мицеллами или бислоями предшествует стадии активации, при которой резко возрастает число оборотов фермента, и экспериментально эти две стадии можно разделить. Такое поведение ничем не отличается от поведения других рассмотренных липидзависимых ферментов. Несмотря на обилие данных по кинетике, связыванию и структуре фосфолипазы, исследователи не пришли к единому мнению о том, что происходит с ферментом при его активации в присутствии липидного бислоя или мицелл. В литературе рассматривается несколько возможных механизмов.Фермент связывается с бислоем с помощью специального "участка узнавания поверхности раздела", отличного от активного центра, и для его формирования необходим Са2 +. Предполагается, что этот участок проникает в глубь мембраны. Эта модель основана, в частности, на данных по специфическому влиянию химической модификации N-концевого участка полипептида на взаимодействие с агрегированными субстратами. Происходящая при взаимодействии участка узнавания с мембраной активация фермента, по-видимому, обусловлена конформационными изменениями белка. Следует отметить, что в кристаллическом виде ферменты из поджелудочной железы быка и свиньи представляют собой мономеры, в то время как фосфолипаза Аг из яда гремучей змеи является димером. Обнаруживаемый в мономерных фосфолипазах участок, который, как предполагают, является "участком узнавания поверхности", в димерном ферменте недоступен из водной фазы и находится на поверхности межсубъединичного контакта.Двухфосфолипидная модель предполагает существование в ферменте двух или более центров связывания фосфолипидов и основана прежде всего на кинетических данных по активации фермента фосфолипидами в смешанных мицеллах. Эта модель позволяет учесть роль агрегации двух или более молекул фермента как важнейшей части схемы активации, а также роль возможных конформационных изменений в увеличении каталитической активности.Постулируется, что конформация фосфолипидного субстрата в агрегированном состоянии отличается от конформации мономерной формы, и именно с этим связана более высокая скорость гидролиза агрегированных форм липидов ферментом.4. Увеличение активности связано с тем, что из мицелл или бислоя продукты гидролиза удаляются легче. Кроме того, само по себе накопление продуктов уже приводит к увеличению активности фосфолипазы Аг, хотя механизм этого явления неясен.Одна из проблем, возникающих при анализе процесса активации, состоит в том, как разделить процессы связывания с липидом и активацию липидом. В экспериментах с однослойными фосфолипидными везикулами удалось выяснить, что критическим параметром для обоих стадий является физическое состояние бислоя. Показано, например, что фосфолипаза А2 лучше всего связывается с дипальмитоилфосфатидилхолином в фазе геля, причем Са2 + для этого не нужен. Для активации же фермента в такой системе, по-видимому, требуется Са2 +, причем в случае везикул фосфатидилхолиновый бислой должен обладать дефектами упаковки и в нем должны происходить структурные флуктуации, подобные тем, которые имеют место в ходе термоиндуцируемого фазового перехода. Взаимодействия молекул белков могут быть важны как для связывания, так и для активации. В некоторых условиях активированный фермент сохраняет активность по крайней мере в течение 30 мин.Лучшими субстратами для фермента являются фосфолипиды с короткой ацильной цепью и небольшими по объему полярными заместителями при фосфате. Хотя для активации фермента кислые фосфолипиды не являются необходимыми, отрицательный заряд на поверхности раздела все же повышает сродство к субстрату. Связавшись с границей раздела, фермент может латерально перемещаться по поверхности бислоя и гидролизовать до нескольких тысяч фосфолипидных молекул в минуту до тех пор, пока не отделится от бислоя. Время пребывания белка на поверхности бислоя в значительной степени зависит от природы липида и свойств окружающего раствора.Какие именно конформационные изменения приводят к активации и каким способом происходит связывание фермента с бислоем, неизвестно. Обнаруживаемая при изучении модельных бислойных систем зависимость кинетики от наличия дефектов бислоя представляется очень интересной, хотя неясно, насколько такие дефекты важны для работы фермента in vivo.И в заключение необходимо отметить, что фосфолипаза Аг ответственна за высвобождение из мембраны арахидоновой кислоты, последующее превращение которой в лейкотриены и простагландины является частью воспалительного процесса. Стероиды, обладающие противоспалительным эффектом, активируют группу белков, называемых липокортинами, которые в свою очередь специфически ингибируют фосфолипазу Аг. Липокортины являются также субстратами протеинкиназы С и тирозиновых протеинкиназ, которые, вероятно, могут таким образом участвовать в регуляции активности липокортинов. Ингибирующий эффект липокортинов, по-видимому, связан не с образованием прочного комплекса с фосфолипазой Аг, а с их взаимодействием непосредственно с мембраной. РезюмеМногие клеточные процессы катализируются мембраносвязанными ферментами. При этом мембрана может выполнять целый ряд функций. Связав фермент с определенной мембраной или участком на мембране, можно локализовать каталитический центр в определенной части клетки. Существует множество примеров, когда несколько действующих последовательно ферментов организованы подобным образом в некий суперкомплекс, что позволяет увеличить суммарную скорость реакции. Многие мембранные ферменты представляют собой белки, пронизывающие мембрану насквозь, и участвуют в трансмембранном транспорте растворенных веществ или в передаче информации с одной стороны бислоя на другую в форме трансмембранного аллостерического сигнала. Другие ферменты являются периферическими мембранными белками и в некоторых случаях способны связываться с мембраной только в ответ на определенный физиологический сигнал.Во многих случаях липидный бислой играет пассивную роль в функционировании мембраносвязанных ферментов, являясь лишь средой, в которой происходит взаимодействие фермента с субстратом. Нередко, однако, оптимальное функционирование мембранных ферментов оказывается возможным только в присутствии определенных липидов, хотя абсолютная специфичность конкретного липида в активации фермента встречается крайне редко. Интерпретировать данные по влиянию липидов на активность изолированных мембранных ферментов часто очень непросто. Изучение очищенных мембранных белков in vitro ставит перед исследователем огромное множество совершенно особых проблем, не встречающихся при работе с растворимыми ферментами.
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
