Молекулярные основы канцерогенеза. Онкогены

* возрастает скорость синтеза и секреции гормонов и некоторых факторов роста (например, секреция тканью рака легкого АКТГ или, реже, инсулина и глюкагона). Опухоли приобретают способность к автономному росту за счет перехода на пара- или аутокринный механизмы регуляции клеточного роста (рис. 3.1). При аутокринном механизме опухоли синтезируют факторы роста (ФР) и рецепторы к ним (рФР) или онкобелки, являющиеся аналогами ФР или рФР. Образованные одной и той же клеткой ФР и соответствующие им рецепторы, взаимодействуя между собой, вызывают аутостамуляцию роста и деления клеток. Так, при раке легкого клетки стромы вырабатывают инсулиноподобный фактор 2, который взаимодействует с рецепторами ткани рака и стимулирует ее рост и деление;

* появляется высокоактивный фермент теломераза или альтернативные пути удлинения теломер. У животных и человека на концах линейных хромосом расположены тысячи высококонсервативных повторов гексадезоксинуклеотидов TTAGGG, называемых теломерами, которые позволяют концам хромосом прикрепляться к ядерной оболочке и предотвращают их деградацию и рекомбинации. При каждой репликации длина теломер укорачивается примерно на 100 пар оснований. Для делящихся соматических клеток укорочение теломер служит репликометром, определяющим количество делений, которое способна совершить нормальная клетка. После достижения теломерными последовательностями критического размера клетки теряют способность к делению и стареют (барьер Хейфлика). Теломераза представляет собой олигомерный фермент рибонуклеопротеин, в котором специфический участок теломеразной РНК служит матрицей для синтеза теломерной ДНК. Механизм удлинения концов эукариотической хромосомы включает следующие этапы: а) связывание G_богатой цепи теломеры с матричным участком теломеразной РНК; б) РНК-зависимый синтез теломерной ДНК из дезоксинуклеозидтрифосфатов; в) транслокацию, т.е. перемещение ДНК, удлиненной на один повтор относительно фермента, и последующее многократное повторение этих стадий (рис. 3.2). Комплементарная нить ДНК достраивается с помощью ДНК-полимеразы.

Таким образом, особенности метаболизма, существование эффективного механизма удлинения теломер и способность к автономному росту дают опухоли не только преимущества в росте и размножении, но ведут к появлению клонов иммортализованных, или бессмертных, клеток.

ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ВЕЩЕСТВ В ОРГАНИЗМЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Опухоль, развивающаяся в организме человека, оказывает постоянное и по мере прогрессирования все более усиливающееся воздействие на обмен веществ, вызывая в итоге нарушения гомеостаза, не совместимые с жизнью.

На относительно ранних этапах опухолевого роста происходит, как считают некоторые авторы, анемизация организма, т.е. недостаточное снабжение тканей кислородом. Этим объясняется повышенный расход глюкозы, а как следствие этого - стимуляция фосфоролиза гликогена в печени, увеличение глюконеогенеза, мобилизация триацилглицеринов (TAG) и образование кетоновых тел. Повышение концентрации липидов в крови ухудшает вязкостные свойства крови и еще больше увеличивает дефицит кислорода. В организме больного развивается также дефицит витаминов, в частности С и Е, являющихся антиоксидантами и снижающими явления перекисного окисления липидов (ПОЛ). Рост опухоли сопровождается увеличением содержания продуктов ПОЛ и повреждением структуры мембран.

Развитие рака и возникающие при этом гипоксия и самоподкисление опухоли изменяют функционирование эндокринной системы: способствуют возникновению резистентности к инсулину и реактивной гиперинсулинемии, гиперпродукции АКТТ, пролактина, тиреотропина и глюкокортикоидов. Последние, стимулируя глюконеогенез из тканевых белков, неблагоприятно воздействуют на клетки иммунной системы, вызывая их деструкцию по механизму апоптоза, что приводит к стойкой иммуносупрессии. В период максимального роста опухоли в тимоцитах и Т-лимфоцитах селезенки ингибируется синтез ДНК на уровне синтеза предшественников - дезок-сирибонуклеозидтрифосфатов.

В центре неоплазмы часто возникают участки некроза, продукты которого всасываются в кровь и разносятся по организму, вызывая повышение температуры тела и другие проявления общей интоксикации.

ФАКТОРЫ, СТИМУЛИРУЮЩИЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Около 80% случаев рака у людей являются результатом воздействия факторов окружающей среды, под которыми понимают стиль жизни (курение, производственные контакты с канцерогенами), пищевые продукты (зерновые, зараженные плесенью Aspergillus flavus, пищевые добавки, содержащие нитриты и вторичные амины), заболевания, увеличивающие риск развития опухолей: так, цирроз печени в ряде случаев ведет к развитию гепатоцеллюлярной карциномы, а язвенный колит - аденокарциномы толстой кишки и т.д. Склонность к опухолеобразованию может стимулироваться возрастом и наследственными изменениями генома. Например, предрасположенность к ретинобластоме или множественному полипозу толстой кишки наследуется как аутосомио-доминантный признак, а нестабильность хромосомной ДНК - как аутосомно-рецессивный.

Физические, химические и биологические воздействия, вызывающие трансформацию клеток, называют канцерогенными воздействиями. К ним относят:

* рентгеновские, ? иУФ-лучи, которые оказывают как прямой повреждающий эффект на структуру ДНК за счет появления разрывов в нитях и нарушений в структуре азотистых оснований» так и непрямой, вызванный действием на макромолекулы свободнорадикальных форм кислорода, образующихся в тканях под воздействием облучения;

* химические вещества: полициклические ароматические углеводороды [бензо(а) пирен, диметилбензантрацен и др.}, ароматические амины и аминоазосоединения (2_нафтиламин, 2_ацетиламинофлуорен), нитрозамины и амиды, афлотоксины, некоторые лекарственные препараты, являющиеся алкилирующими или ацилирующими агентами: циклофосфамид, бисульфан, диэтилстильбэстрол и др. Большинство из указанных соединений сами по себе не являются канцерогенами, но превращаются в них, подвергаясь в печени воздействию ферментов универсальной системы детоксикации ксенобиотиков (рис. 3.3). Образуются эпоксиды, свободные радикалы, ионы карбония или катионы, активные электрофильные группы которых взаимодействуют с нуклеофильными центрами в молекулах ДНК, РНК или белков, нарушают функционирование генетического материала и вызывают возникновение неоплазм;

* ДНК- и РНК-содержащие вирусы, которые встраиваются в клеточный геном и экспрессируют гены и белковые продукты, вызывающие неопластическую трансформацию. Такие гены стали называть онкогенами.

Данные о роли вирусов в развитии опухолей были получены в начале XX столетия. Так, в 1908 г. V. Ellerman и O. Bang вызвали лейкоз у кур воздействием бесклеточного экстракта из опухолевых клеток, а в 1910 г. Rous описал первый онкогенный вирус, способный инициировать саркому у кур. В 1968 г. Л.А. Зильбер сформулировал вирусно-генетическую теорию возникновения неоплазм под действием онкогенных вирусов. Вирусный канцерогенез первоначально был описан только у птиц и животных. В последнее время получены данные об участии вирусов в развитии некоторых опухолей у человека: ДНК-содержащего вируса Эпштейна - Барр в развитии лимфомы Беркитта и назофарингеальной карциномы, ДНК папилломавируса - рака кожи и гениталий; РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека HIV в возникновении сарком, Т-клеточного лимфотропного вируса HLTV 1 как причины некоторых видов Т-клеточных лимфом и лейкемий и др.

ДНК-содержащие вирусы частично или полностью встраиваются в клеточный геном человека, экспрессируют вирусные гены и образующиеся белки в ядре, нарушают реализацию клеточной программы. Так, Т-антиген вирусов SV40 и полиомы, Е7 вируса папилломы человека связываются и инактивируют белки-репрессоры опухолей Rb и / или р53.

К ДНК-онковирусам относят также вирус герпеса, аденовирус, паповавирус, вирус ветряной оспы. Как правило, эти вирусы вызывают инфекционные болезни и лишь в одном из миллиона случаев - злокачественную трансформацию. ДНК-содержащий вирус гепатита В является причиной рака печени, от которого в мире умирает ежегодно около 500 000 человек, хотя и в этом случае инфицирование, как правило, происходит за 20-25 лет до возникновения опухоли.

РНК-онковирусы являются ретровирусами. Попадая в клетки человека, они синтезируют ДНК с помощью обратной транскриптазы и включают ее в эукариотический геном в виде провируса. В 1976 г. при помощи техники рекомбинантных ДНК в ретровирусе саркомы Рауса была расшифрована структура генетического материала (рис. 3.4) и наряду с тремя обычно встречающимися у всех вирусов генами обнаружен ген, ответственный за злокачественную трансформацию и названный src_онкогеном. Показано, что если src_ген встраивается в геном нормальных клеток, растущих в культуре, то они теряют способность к контактному торможению и приобретают все свойства трансформированных клеток.

В 1989 г. Д. Бишоп и Г. Вармус на РНК-содержащих вирусах установили, что онкогены не присущи вирусам исходно, но заимствованы из генома тех клеток, в которых они обитают. За время существования в составе вирусного генома они подвергаются многочисленным мутациям и приобретают онкогенные свойства. В некоторых случаях вирусы не содержат онкогенов, но достаточно случайного внедрения в геном человека чужеродного генетического материала, содержащего энхансеры, или усилители транскрипции, чтобы поменялась экспрессия соседних с ним генов хозяина и произошла их трансформация.

Исследования структуры генома млекопитающих и человека показали, что в эукариотических клетках гены, кодирующие ФР, рФР, транскрипционные факторы и другие белки, вовлеченные в регуляцию роста и дифференцировки, являются структурными аналогами онкогенов, т.е. теми исходными генами, из которых онкогены возникли. Эти нормальные клеточные гены, прототипы онкогенов, не обладают трансформирующими свойствами и их называют протоонкогенами.

В настоящее время изучены десятки вирусных онкогенов, из которых более 50% кодируют в клетках тирозиновые про-теинкиназы (тир-ПК), а остальные содержат информацию о различных функционально активных белках: укороченном факторе роста тромбоцитов (ФРТ), укороченном рецепторе эпидермального фактора роста (рЭФР), ДНК-связывающих, ГТФ-связывающих и некоторых других регуляторных белках.

Вирусные онкогены ответственны за очень небольшую часть неоплазм человека, поэтому внимание молекулярных онкологов главным образом сосредоточено на клеточных онкогенах. Последние возникают в результате точечных мутаций в кодирующих и регуляторных областях протоонкогенов, их амплификации (увеличение числа копий) и активации под влиянием экзогенных промоторов, утраты отдельных аллелей и генных локусов при делениях и хромосомных перестройках, модуляции экспрессии генов на уровне транскрипции и трансляции (рис. 3.5). Показано, что рак чаще возникает из соматических клеток, чем из половых, поэтому можно сказать, что соматические мутации являются причиной основного числа опухолей.

Установлено, что в регуляции роста и дифференцировки зслеток принимает участие более 100 различных генов и около 10 генов - супрессоров опухолевого роста, или антионкогенов (табл. 3.1). Продукты многих онкогенов имеют структурную гомологию с такими ФР и рФР, как эпидермальный ФР (ЭФР), ФР тромбоцитов, ФР фибробластов, инсулиноподобными факторами 1 или 2.

Они обладают либо протеинкиназной активностью, либо являются аналогами регуляторшлх белков мультиферментньпс циклиновых комплексов или ДНК-связывающих белков. Антионкогены (р53, pRb, р21, р16, WT1) кодируют регуляторные белки, сдерживающие репликативный потенциал клеток, поэтому их инактивация влечет за собой нарушение контроля клеточной пролиферации.

В последнее время внимание исследователей-онкологов привлекли гены, кодирующие циклины и циклиизависимые киназы: нормальные регуляторы клеточного цикла и их ингибиторы. Существует также большая группа генов-модуляторов, не вызывающих трансформации, но способствующих распространению опухоли в организма (гены главного комплекса гистосовместимости иммунного ответа; гены, контролирующие функционирование протеолитаческих ферментов, и др.).

Малигнизация клеток является следствием каскадного накопления в геноме различных нарушений. Для развития рака необходимо, чтобы произошли изменения не менее чем в 6 - 10 генетических факторах (теория многоступенчатого канцерогенеза). Изменения в пределах всего одной копии или аллеля протоонкогена достаточны для превращения его в онкоген с возросшей стимулирующей пролиферацию активностью, т.е. онкогены можно рассматривать как доминантные трансформирующие гены. Антионкогены, напротив, проявляются рецессивным образом т.е. для нарушения клеточной пролиферации и дифференцировки необходима инактивация обоих аллелей. Присутствие изменений в обоих аллелях переводит клетку из гетерозиготного в гомозиготное состояние, т.е. наблюдается потеря гетерозиготности - loss of heterozygosity (LOH). Среди генов - супрессоров опухолей исключением является ген р53, повреждение в одном из аллелей которого ведет к изменению функций белка.

Спектр изменений генетического материала в каждой конкретной опухоли имеет индивидуальный характер, однако наличие общих закономерностей для неоплазм определенной локализации дает основание связывать их с патологией определенного органа (см. табл. 3.1).

В большинстве опухолей обнаруживается сразу несколько онкогенов. Особенно часто встречаются мутации в генах - супрессорах опухолей, которые кодируют белки, ингибирующие аномальный рост и трансформацию клеток.

Описано более 10 супрессорных белков. Наиболее изученными из них являются Rb и р53. Так, при ретинобластоме - редком детском онкологическом заболевании сетчатки глаза наблюдается инактивация гена Rbl, кодирующего ядерный белок с мол. массой 105 000. В норме этот белок ингибирует пролиферацию клеток, так как способен связываться и инактивировать транскрипционный фактор EF2, который в свою очередь усиливает экспрессию ростстимулирующих белков и ферментов: ДНК-полимеразы ? (рис. 3.6). Однако Rb перестает влиять на переход клетки из G, в S_период, если он фосфорилирован или инактивирован связыванием с другими белками-ингибиторами, а также в результате мутаций в гене. Это стимулирует пролиферативный процесс.

Другим антионкогеном является Р53. Его функция наиболее часто нарушена у онкологических больных. Этот антионкоген кодирует ядерный белок с мол. массой 53 000, которой, будучи транскрипционным фактором, контролирует в клетках чрезвычайно важные функции: после повреждения ДНК ингибирует пролиферацию и активирует ее репарацию, но если последняя невозможна, то побуждает клетки к апоптозу, а также подавляет ангиогенез в опухолях.

Белок Р53 состоит из трех доменов: регулирующего транскрипцию, обеспечивающего связывание с ДНК и ответственного за олигомеризацию. Он связывается с регуляторными участками ДНК в виде тетрамера и имеет значительное число генов-мишеней, в которых есть последовательности, способные присоединять Р53 и таким образом менять свою активность (рис. 3.7). К генам, экспрессия которых зависит от Р53, относится ген waf l, кодирующий белок - ингибитор циклинзависимой киназы. В последние годы в клетках обнаружена группа белков - циклинов, которые активируют более десятка гомологичных по структуре сер/тре-ПК, названных циклинзависимыми протеинкиназами. Образуя комплексы с циклинами, эти ПК фосфорилируют белки, осуществляющие продвижение клетки по клеточному циклу и обеспечивающие преодоление G1/S и G2/M проверочных точек. Белок Р53 увеличивает экспрессию гена waf l и синтез белка р21.

Другим геном, транскрипция которого усиливается Р53, является gadd 45. Показано, что экспрессия этого гена возрастает в клетках, подвергнутых ионизирующей радиации.

Два гена - bcl_2 и Ьах, чувствительные к Р53, регулируют разрушение клеток путем апоптоза. Однако присоединение к регуляторному участку Р53 прекращает экспрессию гена bcl_2, являющегося ингибитором апоптоза, и активирует ген bах, который стимулирует апоптоз.

Белок Р53 увеличивает экспрессию гена тромбоспондина, который кодирует белок, препятствующий росту кровеносных сосудов в опухоли - ангиогенезу и, следовательно, предотвращающий метастазирование.

Центральная роль Р53 в регуляции метаболизма клетки объясняет, почему частота мутаций в гене этого белка особенно велика. Так, у людей мутации в этом гене обнаружены практически во всех типах опухолей. Они наблюдаются в 70% случаев рака толстой кишки, 56% рака легкого и 40-45% случаев рака яичников, пищевода, поджелудочной железы, кожи и желудка.

Таким образом, согласно современным представлениям, инактивация, амплификация или накопление мутаций в генах, кодирующих белки, участвующие в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза, включение механизма поддержания длины теломер создают предпосылки для трансформации и иммортализации клеток.

Возникло направление генной терапии, которое ставит перед собой задачу найти способы восстановления функций генов, ингибирующих пролиферацию и рост, и выключения онкогенов, нарушающих согласованность процессов роста, дифференцировки и апоптоза. Это вселяет надежду, что в ближайшие годы человечество сможет более эффективно бороться за жизнь и здоровье онкологических больных.