Конструирование, клонирование и отбор рекомбинантных молекул ДНК
Конструирование, клонирование и отбор рекомбинантных молекул ДНК
2
Конструирование, клонирование и отбор рекомбинантных молекул ДНКРассмотрим процесс получения клонированных ДНК. На первом этапе готовят фрагменты ДНК, пригодные для последующего лигирования с векторной молекулой. Следующий этап состоит в самом лигировании. Эти процессы осуществляются in vitro. Далее рекомбинантные молекулы вводят в клетки, где они амплифицируются путем репликации. Затем проводят клонирование, отбор и дальнейшую амплификацию.Вставкиа. Общие положенияПри конструировании рекомбинантных молекул обычно используют сложные смеси потенциальных вставок, и в результате образуется целый набор клонов, из которого путем скрининга и отбора получают нужные рекомбинантные молекулы. Скрининг и отбор можно значительно упростить, если обогатить исходную смесь нужным сегментом; в этом случае для выявления искомого рекомбинанта приходится проверять значительно меньше рекомбинантных клонов. С одной стороны, для конструирования рекомбинантных ДНК можно использовать очищенные фрагменты ДНК, а с другой - само молекулярное клонирование является наиболее простым и эффективным способом очистки фрагментов. Клонирование представляет собой также наиболее эффективный способ получения большинства фрагментов геномной ДНК в значительных количествах.Существует три источника вставок для клонирования:1) геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, либо физическими методами, например с помощью ультразвука;2) синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или ферментативным методом либо путем объединения этих двух методов;3) сегменты ДНК, полученные с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro. При расщеплении ДНК эндонуклеазами часто образуются фрагменты, способные к непосредственному лигированию с подходящими липкими или тупыми концами вектора. В других случаях соответствующие концы присоединяют к фрагментам перед лигированием.б. Вставки геномной ДНКЭндонуклеазное расщепление. Наиболее прямой способ получения вставок состоит в расщеплении суммарной геномной ДНК какого-либо организма или вируса с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Метод отличается высокой воспроизводимостью: специфический фермент разрезает данную ДНК с образованием уникального набора фрагментов. Если при эндонуклеазном расщеплении образуются липкие концы, соответствующие концам векторной молекулы, то клонирование осуществляют сразу или после обогащения популяции фрагментами для получения нужной вставки.Обогащение смеси нужными фрагментами. Для эффективного разделения сложных смесей фрагментов используют два метода: электрофорез в полужидкой среде и жидкостную хроматографию высокого разрешения с обращенной фазой. Однако ни один из этих методов не позволяет получить фрагменты в чистом виде. Обычно препараты содержат примеси других фрагментов, имеющих близкую длину или обладающих такой же способностью к элюции. Тем не менее можно получить значительное обогащение смеси в отношении нужного фрагмента, что облегчает его выявление в большой коллекции клонов.При электрофорезе и хроматографии разделение фрагментов ДНК основывается на их различии по размеру и нуклеотидному составу. Если размер генома невелик, то образуется относительно небольшое число хорошо разделяющихся фрагментов; их легко выделить, собрав нужные фракции элюата с хроматографической колонки или вырезав кусочки агарозного геля. Однако если расщепляется крупный геном, то хорошо отделяются лишь некоторые фрагменты. Чаще получается непрерывный набор фрагментов всевозможных размеров. Чтобы понять, в чем тут дело, проведем простой расчет. Типичный гаплоидный геном млекопитающих содержит примерно 3*109 п. н. Грубую оценку числа фрагментов, образующихся при исчерпывающем расщеплении эндонуклеазой, можно получить, разделив размер генома на предполагаемое среднее расстояние между двумя соседними сайтами для данной рестриктирующей эндонуклеазы. Для фермента, узнающего участок из шести пар оснований, среднее расстояние между сайтами будет равно 46 п. н. Если размер сайта узнавания равен четырем парам нуклеотидов, то он будет встречаться примерно один раз на каждые 44 п. н. При расщеплении ДНК млекопитающих ферментами, которые разрезают молекулу по сайтам узнавания длиной шесть пар нуклеотидов, образуется примерно 7*105 уникальных фрагментов, а ферментом, сайт узнавания которого составляет четыре пары нуклеотидов, - 12*106 фрагментов. В результате получается непрерывное распределение фрагментов по длинам. При этом некоторые фрагменты вообще невозможно выявить, поскольку они представлены в очень малом количестве.Идентификация специфических фрагментов. Проблемы, возникающие при идентификации фрагментов. При расщеплении примерно 50 мкг геномной ДНК и последующем электрофорезе препарата масса сегмента ДНК длиной 1000 п. н., встречающегося в геноме лишь один раз, составляет всего 17*10-6 мкг, или 17 пг. Как идентифицировать этот специфический фрагмент? Если имеется гомологичная ДНК или препарат комплементарной РНК, которые можно использовать в качестве зонда при гибридизации, то интересующий нас фрагмент можно обнаружить при отжиге зонда с фрагментами после их денатурации. Так, в качестве зонда можно использовать очищенную мРНК, соответствующую гену, который мы хотим клонировать. Иногда в роли зонда выступает гомологичный ген, клонированный в другом организме и имеющий достаточно близкую структуру. Чтобы выявить гибрид, нужно использовать меченый зонд. Чаще всего его метят радиоактивным изотопом.Определив примерный размер интересующего нас фрагмента, можно элюировать материал соответствующей области другого геля, не прошедшего гибридизацию, и использовать этот материал для клонирования. Аналогичным образом можно тестировать фракции после хроматографического разделения фрагментов на колонке.Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных описанным выше, ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подходящую подложку. Этот метод широко используется, например, для идентификации специфических РНК и белков после их электрофоретического разделения. Блоттинг ДНК назван по имени его изобретателя блоттингом по Саузерну; соответствующие методики для РНК и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга.Гибридизация меченого зонда с фрагментами ДНК, находящимися в геле, происходит очень неэффективно. Поэтому перед отжигом фрагменты переносят из геля на более подходящую твердую подложку, обычно на нитроцеллюлозный фильтр или нейлон. Сначала гель обрабатывают щелочью, чтобы произошла денатурация ДНК. Затем на него накладывают твердую подложку и пропускают через гель буферный раствор. В результате фрагменты ДНК переходят на подложку с сохранением их взаимного расположения. Далее инкубируют подложку в растворе, содержащем 32Р-зонд, при такой ионной силе и температуре, которые обеспечивают образование водородных связей между зондом и комплементарным фрагментом ДНК. Чувствительность метода зависит от удельной радиоактивности зонда и позволяет зарегистрировать фрагменты, когда их количество измеряется пикограммами. Например, 32Р-меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, имеют удельную радиоактивность более 100 имп. /мин на 1 пг, что достаточно для визуализации радиоавтографов.Случайная фрагментация геномной ДНК. Длинные молекулы ДНК легко ломаются даже при незначительных гидродинамических напряжениях, и их можно подвергнуть случайной фрагментации с помощью ультразвука, путем быстрого перемешивания раствора или пропускания его через небольшое отверстие. Для получения случайного набора перекрывающихся фрагментов можно использовать и рестриктирующие эндонуклеазы, если проводить опыт в таких условиях, когда расщепление происходит лишь в небольшом числе имеющихся сайтов. Средний размер образующихся фрагментов зависит от величины прикладываемого усилия и от концентрации эндонуклеазы. Обычно ДНК выделяют из большой популяции клеток, поэтому исходные ее препараты всегда представлены большим числом идентичных геномов. Каждый сегмент ДНК присутствует в конечном наборе во фрагментах разных размеров, что не позволяет очистить его перед клонированием. Тем не менее, случайные наборы фрагментов имеют преимущество перед наборами, получаемыми в результате полного гидролиза рестриктирующей эндонуклеазой, поскольку вероятность нахождения хотя бы одной копии нужного сегмента целиком в одном фрагменте у них значительно выше.Вырезание определенных сегментов хромосом. Если положение данного гена в хромосоме известно и хромосома достаточно велика, чтобы проводить с ней различные манипуляции, можно выщепить ее часть, которая содержит нужный ген. Этим требованиям удовлетворяют политенные хромосомы слюнных желез Drosophila. Каждая такая хромосома содержит более 1000 копий ДНК, расположенных параллельно друг другу, так что небольшой сегмент может включать 1000 копий определенного гена. Генетические и цитогенетические исследования позволили более или менее точно установить положение многих генов Drosophila. Используя фазово-контрастную микроскопию, можно локализовать область хромосомы, содержащую определенный ген, и вырезать ее тонкой иглой. Таким методом получают сегменты генома длиной около 200 т.п. н., которые далее разрезают рестриктирующими эндонуклеазами и включают в векторные молекулы. Достигаемое при этом обогащение весьма значительно, поскольку на долю 200 т.п. н. приходится лишь около 0,1% от 1,8*108 п. н., составляющих весь геном.в. Синтетические вставкиУспехи, достигнутые в создании методов химического синтеза, позволили синтезировать из простых нуклеозидов молекулы ДНК длиной до 50 остатков. Такие молекулы, которые трудно получить другим путем, можно затем клонировать и выделить в больших количествах. Например, скрининг определенного гена может оказаться невозможным в отсутствие соответствующего зонда. Однако такой ген можно синтезировать in vitro, если исходя из аминокислотной последовательности соответствующего полипептида установить нуклеотидную последовательность. Именно таким способом были впервые клонированы в клетках Е. coli сегменты, кодирующие гормоны соматостатин и инсулин. Эти сегменты получали, синтезируя отдельные олигонуклеотидные блоки и объединяя их затем при помощи ДНК-лигазы. Было синтезировано восемь коротких одноцепочечных фрагментов ДНК. Их отжигали и получали двухцепочечные молекулы, стабилизированные водородными связями, образующимися между комплементарными концевыми последовательностями. Поскольку все синтетические продукты имели на 5'-концах гидроксильные группы, перед лигированием концы фосфорилировали с помощью полинуклеотидкиназы и АТР. Соответствующие фосфатные группы окрашены. Впоследствии из 66 коротких синтетических фрагментов был воссоздан ген инсулина длиной 514 п. н. Следует отметить, что в связи с вырожденностью генетического кода установление истинной нуклеотидной последовательности гена исходя из известной последовательности аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде оказывается невозможным. Тем не менее, удалось определить и синтезировать функциональную кодирующую последовательность.Синтезировать нуклеотидную последовательность целого гена очень трудно. Однако большую ценность представляет синтез даже коротких участков кодирующей последовательности, поскольку в отсутствие других зондов участки длиной 15-20 нуклеотидов можно использовать в качестве специфических зондов при гибридизации. Синтетические зонды используются при саузерн - и нозерн-гибридизации, а также для скрининга рекомбинантных клонов. Кроме того, короткие синтетические последовательности применяются в качестве праймеров при определении нуклеотидных последовательностей длинных сегментов ДНК, а также при ферментативном синтезе ДНК на молекулах РНК с помощью обратной транскриптазы. Другой важной областью применения описанной технологии синтеза является получение коротких сегментов ДНК, содержащих сайты узнавания для известных рестриктирующих эндонуклеаз. Такие сегменты-линкеры лигируют с тупыми концами фрагментов ДНК, встраиваемых в векторные молекулы.Химический синтез полидезоксинуклеотидов. Для химического синтеза полидезоксинуклеотидов широко применяют два метода. В обоих случаях исходными строительными блоками являются дезоксирибонуклеозиды, и оба метода включают этап связывания мононуклеотидов и олигонуклеотидов. Методы полностью автоматизированы; при этом используется установка "Синтезатор ДНК".Независимо от метода первым условием является защита тех реакционноспособных групп дезоксинуклеозидов, которые не участвуют в связывании. Так, аминогруппы дезоксиаденозина и дезоксицитозина обычно бензоилируют, а к аминогруппе гуанозина присоединяют остаток изомасляной кислоты. Тимидин, у которого аминогруппа отсутствует, используется немодифицированным.5'-гидроксильные группы обычно защищают путем образования эфирной связи с 4,4'-диметокситрифе-нилметильным соединением, которое называют диметокситритилом, или сокращенно 2Тг. По завершении синтеза все присоединенные группы должны быть удалены. Свободные аминогруппы восстанавливаются при мягком щелочном гидролизе аминоацильных единиц, а диметокситритильные группы удаляются с помощью мягкого кислотного гидролиза.Фосфаттриэфирный метод. Нуклеозид с присоединенной диметокситритильной группой можно без каких-либо дополнительных модификаций использовать для синтеза фосфодиэфира путем присоединения к З'-ОН-группе, например, и-хлорфенилфосфордихлоридата. Этот диэфир может служить прямым предшественником 5'-конца новой цепи. Далее такой диэфир превращается в триэфир с помощью, например, р-цианоэтанола. Затем 5'-диметокситритиль-ная группа удаляется путем мягкого кислотного гидролиза, в результате чего образуется реакционноспособная 5'-гидроксильная группа. Диэфир и триэфир смешивают в присутствии реагентов, стимулирующих их связывание, обычно арилсульфониловых соединений, например триизопропилбензолсульфонилхлорида. Точный механизм связывания неизвестен. Продуктом реакции является полностью защищенный динуклеотид. При удалении всех защищающих групп образуется простой динуклеозидмонофосфат. Существенно, что полностью защищенный динуклеотид является хорошим исходным продуктом для создания более крупных молекул. При обработке кислотой или ZnBr2 диметокситритиловая группа удаляется и динуклеотид может играть роль З'-конца растущей цепи. При обработке же триэтиламином преимущественно гидролизуется цианоэтиловый эфир, в результате чего динуклеотид приобретает реакционноспособный 3'-конец, который может служить 5'-концом удлиняющейся цепи. Связывание двух динуклеотидов дает тетрануклео-тид. Аналогично соответствующим образом защищенные мононуклеотиды и олигонуклеотиды могут соединяться в длинные блоки. В зависимости от выбора исходного материала синтез цепей ДНК идет в направлении 3'->5' или 5'->3'.Фосфаттриэфирный метод можно упростить и процесс синтеза ускорить, если фиксировать один из концевых нуклеотидов с помощью гидроксильной группы на твердом носителе. В принципе фиксирована может быть любая гидроксильная группа, но обычно реакция идет лучше, если закреплен 3'-гидроксил. Обычно фиксация осуществляется путем образования эфирной связи между 3'-ОН-группой и карбоксильной группой на носителе, например на пористом стеклянном шарике. В этом случае первый нуклеотид оказывается фиксированным, а 3'-ОН-группа - защищенной. Далее последовательно добавляются нуклеотиды или олигонуклеотиды с 5'-ОН-группами, защищенными диметокситритилом. Перед каждым следующим этапом присоединения диметокситритил удаляется, в результате чего образуется свободная 5'-ОН-группа, по которой может происходить дальнейшее наращивание цепи. По окончании синтеза полидезоксинуклеотид отсоединяют от носителя с помощью щелочного гидролиза. При такой процедуре синтеза не нужно проводить дополнительную очистку после каждого акта наращивания цепи, как при других способах. Метод с использованием фиксации на носителе был автоматизирован, при этом синтез полимера длиной 10-20 нуклеотид занимал несколько суток.Фосфиттриэфирный метод. Основным исходным продуктом в этом случае тоже являются дезоксинуклеозиды с защищенными аминогруппами и 5'-диметокситритило-вой группой.3'-гидроксильная группа концевого нуклеозида защищена путем фиксации ее на твердом носителе с помощью эфирной связи. Предшественником следующего остатка является защищенный дезоксинуклеозид-З'-фосфорамидит, который активируется с помощью тетразола. Скорость процесса и его эффективность зависят от фосфорамидитов, стабильных и эффективно связывающихся, легко синтезируемых агентов. Промежуточным продуктом реакции связывания является фосфит. Он окисляется до фосфата с помощью йода. Как и в предыдущем случае, триэфир защищает новую межнуклеотидную связь от гидролиза во время последующих этапов синтеза. По завершении синтеза цепи удаляют различные защищающие группы и освобождают полидезоксинуклеотид от твердого носителя с помощью щелочного гидролиза. Фосфитный метод с твердыми носителями, полученными на основе силикагелей, применяют при автоматизированном последовательном синтезе олигодезоксири-бонуклеотидов. Присоединение каждого нуклеотидного остатка занимает менее 15 мин, при этом могут синтезироваться цепи длиной до 50 остатков с хорошим выходом.Ферментативные методы. Ферментативный синтез коротких полидезоксирибонуклеотидов с заданной последовательностью представляется менее сложным, чем химический синтез, и соответствующие процедуры более просты в исполнении. Для ферментативного синтеза не нужно использовать защитные соединения. Однако реакции имеют свои ограничения и с трудом поддаются контролю. При синтезе используется бактериальный фермент полинуклеотидфосфорилаза, специфичный в отношении рибонуклеотидов, но способный катализировать и полимеризацию дезоксирибонуклеотидов, если вместо Mg2+ использовать Мп2+. Субстратами всегда служат дезоксирибонуклеозидфосфаты, при этом никакой матрицы не требуется. К праймерам длиной не менее трех остатков присоединяются за один раз один или два дезоксирибонуклеотидных остатка. Химический и ферментативный методы: могут применяться совместно. При этом используется либо ДНК-полимераза I, либо обратная транскриптаза.г. Копирование РНК с образованием ДНКМетоды, использующиеся для анализа РНК, менее совершенны, чем аналогичные методы исследования ДНК. Чтобы определить первичную структуру молекулы РНК, проще всего получить с нее ДНК-копию, клонировать эту копию и определить ее нуклеотидную последовательность. Молекулы ДНК, синтезируемые путем ферментативного копирования РНК-матрицы, получили название кДНК. В качестве матриц могут использоваться очищенные РНК или смесь молекул РНК, например мРНК из какой-либо ткани или популяции клеток.Хорошим источником РНК являются высоко дифференцированные ткани и клетки, продуцирующие в большом количестве определенные мРНК. Например, в первых успешных работах по исследованию семейства овальбуминовых генов, в которых была применена техника работы с рекомбинантными молекулами ДНК, использовали мРНК, выделенную из специализированных клеток, синтезирующих в большом количестве определенные белки. Клонированные кДНК использовались в качестве зондов для выделения соответствующих генов.Копирование эукариотической мРНК. На первом этапе последовательность мРНК копируют с помощью обратной транскриптазы и получают комплементарную одноцепочечную ДНК. РНК служит матрицей, а в качестве праймера используется короткая последовательность oligo, комплементарно спаренная с oligo на конце РНК. На втором этапе осуществляют деградацию РНК-матрицы либо с помощью рибонуклеазы, либо путем щелочного гидролиза. Затем используют одноцепочечную кДНК в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы I или обратной транскриптазы. На этом этапе праймер не нужен, поскольку на 3'-конце первой структуры временно образуется шпилька варьирующей длины, которая и служит праймером. На последнем этапе эту шпильку разрезают с помощью нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК, и получают дуплексную кДНК.Копирование других РНК. Для получения кДНК на основе геномов некоторых РНК-содержащих вирусов или других молекул РНК, не имеющих на конце oligo, необходимы некоторые ухищрения. В частности, к 3'-ОН-концу РНК можно присоединить участок poly, используя ро1у-полимеразу и АТР. Далее всю последовательность реакций можно проводить так же, как и раньше. Альтернативный подход состоит в отжиге с даннойРНК олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного какому-либо участку молекулы, для образования праймера.Осложнения. На практике же на каждом этапе, начиная с приготовления очищенного препарата мРНК, возникают сложности, в результате чего конечный продукт обычно представляет собой смесь молекул кДНК, большинство из которых оказываются более короткими, чем полноразмерная РНК. Перечислим некоторые из возникающих проблем.1. мРНК может частично деградировать при выделении под действием рибонуклеаз.2. мРНК может копироваться неполностью, в результате чего на 5'-конце кДНК будет недоставать каких-то последовательностей. Чем длиннее молекула РНК, тем больше вероятность, что эта проблема возникнет.3. Синтез второй цепи ДНК может остановиться прежде, чем кончится матрица, так что З'-конец РНК будет пропущен. Оставшийся конец первой цепи будет удален с помощью нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочечных молекул.4. Нуклеаза может отщепить не только шпильку, но и концы дуплекса.Все это, а также тот факт, что даже высоко очищенные препараты РНК никогда не бывают абсолютно гомогенными, приводит к тому, что препараты двухцепочечных молекул кДНК всегда представляют собой смесь разных молекул. Разделить такие смеси невозможно ни физическими, ни химическими методами. Однако с помощью молекулярного клонирования кДНК удается получить абсолютно чистые сегменты ДНК.Серьезные проблемы, возникшие при синтезе полноразмерных копий кДНК на РНК-матрицах с помощью стандартных методов, определили неудачу многих экспериментов. Чтобы решить эти проблемы, пришлось затратить много усилий. Один из путей состоял в отказе от использования нуклеа-зы. В этом случае к З'-концу первой цепи ДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы присоединяли poly и использовали о%о-праймер для синтеза второй цепи.Метод, в котором устранен главный недостаток, свойственный стандартному методу, - синтез неполных копий РНК. Во-первых, oligo-праймер включается в состав плазмидного вектора Е. coli, так что кДНК может синтезироваться непосредственно на векторе. В результате исключаются этапы выделения и лигирования. Во-вторых, не применяется специфичная к одноцепочечной ДНК нуклеаза, благодаря чему последовательности, соответствующие З'-концу мРНК, не утрачиваются. В-третьих, молекулы ДНК, синтез которых не доходит до конца РНК-матрицы, содержат заглубленный З'-конец, который является неэффективным субстратом для терминирующей трансферазы. При таком подходе получают популяцию рекомбинантных ДНК, обогащенную полноразмерными копиями РНК в виде кДНК, способными осуществлять трансфекцию клеток-хозяев.Немного модифицировав этот метод, можно получить плазмиды, содержащие молекулы кДНК в форме, способной экспрессироваться в клетках эукариот. Модификация состоит во включении эукариотического промотора и сигналов процессинга РНК в линкерный сегмент.Лигирование вектора со вставкойПосле того как получены вектор и вставка, можно приступать к конструированию рекомбинантных ДНК. Обычно нужно осуществить только два двухцепочечных соединения независимо от того, представляет ли собой вектор линейную плазмиду или вирусный геном или два плеча ДНК фага X объединены в одну линейную молекулу по cos-сайтам. Если вставки имеют тупые концы, то перед лигированием для его облегчения к ним часто присоединяют липкие концы.а. Соединение концовРассмотрим четыре возможные ситуации: вектор и вставка имеют полностью совпадающие липкие концы; две разные пары совпадающихконцов; тупые концы; пару совпадающих липких и пару тупых концов. Структура вектор-вставка, в которой каждый из компонентов содержит один липкий и один тупой концы, может образоваться только одним способом. То же самое относится к случаю, когда вектор и вставка имеют по два разных совпадающих липких конца. В тех же случаях, когда каждая молекула имеет два идентичных липких конца или два тупых конца, вставка может быть встроена в любой из двух возможных ориентации относительно вектора, в результате чего образуются два разных продукта. Липкие концы вектора и вставки соединяют с помощью ДНК-лигазы в условиях, способствующих образованию водородных связей между комплементарными участками. Для объединения тупых концов ДНК-лигаза Т4 и фрагменты должны присутствовать в высоких концентрациях, поскольку лигаза имеет низкое сродство к тупым концам.Помимо лигирования вектора и вставки может происходить внутримолекулярное лигирование этих двух компонентов, в результате чего выход ре-комбинантных молекул снижается. Вероятность таких побочных реакций можно уменьшить, проводя перед лигированием дефосфорили-рование либо вектора, либо вставки. В отсутствие 5'-фосфомоноэфирных групп внутримолекулярное лигирование осуществляться не может. Обычно дефосфорилируют векторную молекулу, чтобы свести к минимуму ее способность к амплификации после трансфекции. Вставка, замкнувшаяся в кольцо, не способна к репликации, поэтому с ней возникает меньше проблем. Рекомбинантная молекула, образовавшаяся из дефосфорилированной векторной молекулы, содержит по одному пробелу в каждой из цепей. Такие молекулы легко репарируются в клетках соответствующих хозяев.
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
