Клеточная поверхность: рецепторы, рециклирование мембран и передача сигналов

Одной интересной особенностью интегринов является наличие их разновидностей, содержащих одинаковые в_субъединицы, которые представлены по меньшей мере тремя типами. Однако четко разграничить функции а- и б-субъединиц, считая, что одни из них ответственны за связывание с внеклеточными элементами, а другие - с внутриклеточными, не удается. Так, было показано, что способность интегрина цыпленка к связыванию полностью утрачивается при диссоциации субъединиц и восстанавливается при реконструкции гетеродимера.

Примеры некоторых интегринов

1. Рецепторы для белков внеклеточного матрикса птиц и млекопитающих. Они связываются с гликопротеиновыми компонентами внеклеточного матрикса, в частности с фибронектином, ламинином и витронектином. Связывание с рецепторами в большинстве случаев конкуретно блокируется пептидами, содержащими трипептид RGD. Было показано, что фибронектин опосредует клеточное движение, и ясно, что рецептор фибронектина и его внутриклеточные контакты имеют решающее значение для клеточного морфогенеза.

Гликопротеины тромбоцитов. По и Ша являются гликопротеинами мембран тромбоцитов, гомологичными а- и /3_субъединицам других интегринов. Этот поверхностный рецептор участвует в агрегации тромбоцитов, происходящей при свертывании крови. Тромбоциты не агрегируют до тех пор, пока не произойдет «активация» одним из агонистов - тромбином, коллагеном или адреналином. Процесс активации детально не изучен, но одним из ее результатов является увеличение доступности комплекса на поверхности тромбоцитов, в результате чего он может взаимодействовать с циркулирующими макромолекулярными «адгезивными» белками, в том числе с фибриногеном, фибронектином и фактором фон Виллебранда. Это связывание зависит от кальция. Фибриноген двухвалентен и, вероятно, более важен для связывания тромбоцитов в каскаде агрегации. Плазматический фактор фон Виллебранда является многофункциональным гликопротеином, который обладает сродством не только к активированному интегрину, но и к коллагену. Следовательно, этот белок адгезии способствует прилипанию активированных тромбоцитов к сосудистому субэндотелию, который становится доступным для них при нарушении целостности эндотелиальных клеток после ранения. Фактор фон Виллебранда связывается также с другим рецепторным белком тромбоцитов, глнкопротеином lb.

Лейкоцитарные белки адгезии. Для того чтобы мигрировать к месту инфекции и воспаления, лейкоциты должны вступить во взаимодействие с эндотелиальными клетками сосудов. Идентифицированы три гетеродимерных рецептора, участвующие в адгезии лейкоцитов; все они относятся к семейству интегринов. По-видимому, все три белка имеют одинаковые /3_субъедини-цы. Один из них, LFA_1, связывается со специфическим глнкопротеином клеточной поверхности ICAM4, присутствующим на фибробластах. Это взаимодействие может опосредовать связывание Т-лимфоцитов с фибробластами при воспалении.

Позиционно специфические антигены дрозофилы. По-видимому, семейство рецепторов, необходимых для нормального эмбрионального морфогенеза дрозофилы, также принадлежит к семейству интегринов. В присутствии пептидов, содержащих последовательность RGD, происходит нарушение эмбриогенеза и блокируется гаструляция у Drosophila.

2.6 Другие способы связывания с матриксом и белками адгезии

Интегрины не уникальны в своих свойствах, касающихся связывания с внеклеточным матриксом и белками адгезии. Показано, что ламинин, тромбоспондин и фактор фон Виллебранда специфически связываются с гликолнпидами, содержащими сульфогруппы. Физиологическое значение этого взаимодействия неясно. Фермент 5' - нуклеотидаза также участвует во взаимодействии как с внеклеточными, так и с внутриклеточными компонентами, хотя роль этого взаимодействия in vivo не доказана. Существуют также рецепторы ламинина, которые не относятся к семейству интегринов.

Всесторонне изучена агрегация диссоциированных клеток губки. Для инициации этого процесса должно произойти связывание некоего высокомолекулярного фактора с внеклеточным доменом рецептора агрегации, находящимся в плазматической мембране. Это, по-видимому, служит сигналом к запуску быстрого распада фосфатидилинозитола и образованию внутриклеточных вторых посредников, которые инициируют агрегацию, опосредованную фактором сборки коллагена. Коллагеновые тяжи служат матриксом, на котором сорбируются клетки губки.

3. Повторное использование мембран и эндоцитоз с участием рецепторов

До сих пор мы считали мембрану животной клетки статичной структурой, состав которой изменяется только во время роста клетки или при дифференцировке. На самом деле клеточная поверхность чрезвычайно динамична и составляет вместе с клеточными мембранными органеллами часть сложной сети мембранного транспорта. Мембранный транспорт можно разделить на две составляющие: эндоцитоз и экзоцитоз. Эндоцитоз - это поглощение внеклеточной жидкости и частиц в составе мембранных пузырьков, а экзоцитоз включает процессинг новосинтезированных белков и липидов и их доставку к месту секреции или включения в плазматическую мембрану, лизосомы или вакуоли. В обеих системах происходит селективный перенос специфических мембранных компонентов между мембранами внутри клетки с помощью везикул, которые отшнуровываются от одной мембраны и сливаются с другой. Важнейшей особенностью регуляции этих процессов является закисление везикул и вакуолей с помощью Н + - АТРаз.

3.1 Общие свойства эндоцитозного пути

Разграничим процессы поглощения клеткой крупных частиц, растворенных веществ и жидкости. Поглощение крупных частиц называется фагоцитозом и характерно только для клеток некоторых типов. Процесс активируется частицами и чувствителен к цитохалазину. После образования промежуточной фагосомы везикула закисляется и затем сливается с лизосомой, содержащей ферменты деградации.

В основе поглощения жидкости и опосредованного рецепторами поглощения растворенных веществ лежит образование окаймленных ямок и окаймленных везикул. Термин «окаймленные» относится к морфологии этих структур, выявляемой с помощью электронной микроскопии. Отличительной их особенностью является наличие решетчатой структуры из молекул белка клатрина, который связывается с углублениями на поверхности плазматической мембраны и везикулами, образующимися из таких ямок. Возможно, существуют и другие эндоцитозные пути без участия окаймленных везикул, однако о них известно немного. Окаймленные везикулы участвуют и в экзоцитозе.

На долю окаймленных ямок обычно приходится всего 1 - 2% общей площади поверхности плазматической мембраны, и большинство белков плазматической мембраны не обнаруживаются на этих участках. Однако концентрация некоторых белков в этих ямках очень высока. Например, в них сосредоточено около 70% белка - рецептора липопротеина низкой плотности. В некоторых случаях сродство рецептора к окаймленным ямкам постоянно, в других рецептор концентрируется в них только при связывании лиганда. В табл. 9.2 перечислены некоторые рецепторы плазматической мембраны, участвующие в поглощении специфических лигандов с помощью окаймленных ямок и везикул.

Таблица 9.2

Некоторые рецепторы, интернализуемые при эндоцитозе

По-видимому, после образования эндоцитозных везикул оболочка из клатрина удаляется специфическим белком в ходе АТР-зависимой реакции. Эти данные получены в экспериментах in vitro; роль указанного белка in vivo пока не выявлена. Везикулы без клатрина становятся частью сложной системы трубочек и везикул, называемых периферическими эндосомами; они локализованы вблизи плазматической мембраны. На основе функциональных и морфологических различий субпопуляциям эндосом были присвоены различные названия. Мы будем называть их просто эндосомами. Существует также система эндосом, локализованных вблизи центриолей и комплекса Гольджи; они называются перинуклеарными эндосомами. Эти структуры почти наверняка также участвуют в эндоцнтозном мембранном транспорте. Конечный пункт эндоцитозного пути находится во вторичных лизосомах, где происходит деградация отдельных растворенных веществ.

Скорость, с которой происходит рециклирование мембран, поистине удивительна. Ее можно определить с помощью водорастворимых, не проникающих в мембрану меток, оценивая скорость поглощения клеткой внеклеточной жидкости. К таким меткам относятся, например, радиоактивный инулин, декстран, краситель люцифер желтый. Измерения, проведенные на гепатоцитах с использованием инулина, показали, что эти клетки поглощают путем эндоцитоза за 1 ч количество жидкости, составляющее не менее 20% их объема, и количество мембранного материала, по площади превышающее в пять раз площадь их базолатериальной плазматической мембраны! Скорость эндоцитоза у других типов клеток не столь велика, но также впечатляет; например, макрофаги поглощают за 1 ч мембранный материал, площадь которого вдвое превышает площадь их поверхности, а адипоциты - материал, по площади составляющий 0,2 площади их поверхности. Большая часть жидкости, поглощаемой клетками, быстро выводится из них зa характерное время от 1 мин до 20 мин. Возможно, между плазматической мембраной и периферическими эндосомами устанавливается динамическое равновесие, причем на долю эндосом приходится лишь около 3% общего объема клетки. Кроме того, некоторая часть инулина, поглощаемого i епатоцитами, поступает в гораздо медленнее обменивающийся внутренний пул, что, возможно, отражает попадание его в другие внутренние вакуоли, например в лизосомы.

Эти данные свидетельствуют об исключительной динамичности поверхности мембран. Бретчер обратил внимание на то, что если бы какой-то участок плазматической мембраны включался в одном месте клеточной поверхности и появлялся в другом, то это означало бы, что существует однонаправленный мембранный по-

ток. Это представление было положено в основу модели, объясняющей механизм амебоидного движения клетки таким же образом, как и «кэпииг» поверхностного антигена. Кэпинг наблюдается как у лимфоцитов, так и у других типов клеток; он инициируется агрегацией белков плазматической мембраны, обычно путем связывания мультивалентного лнганда с каким-то компонентом клеточной поверхности. Связанный компонент агрегирует с образованием «очажков», которые затем объединяются в один крупный агрегат - кэп. Далее происходит поглощение белковых агрегатов. Было высказано предположение, что первые белковые агрегаты пассивно увлекаются предполагаемым массовым мембранным потоком, при этом они концентрируются около места интернализацин. Альтернативная точка зрения, гораздо более распространенная, заключается в том, что кэпинг - это активный процесс, протекающий при прямом участии элементов цитоскелета. Интересно отметить, что ганглиозиды также можно индуцировать для образования кэпа на лимфоцитах.

3.2 Сортировка компонентов комплекса рецептор-лиганд

В результате эндоцитоза и быстрого рециклирования плазматической мембраны происходит поглощение не только жидкостей. Одна из основных функций этого процесса состоит в облегчении поглощения внеклеточных белков. Большинство рецепторов, перечисленных в табл. 9.2, которые концентрируются в окаймленных ямках, связываются с такими макромолекулярными лигандами, как гликопротеины, липопротеины низкой плотности или иммуноглобулины. Кроме того, имеются рецепторы для факторов роста и таких гормонов, как ФРЭ или инсулин, когда в результате рециклирования плазматическая мембрана быстро освобождается от комплексов гормон-рецептор, заменяемых ново синтезированными рецепторами. Структурные детерминанты, которые опосредуют связывание этих рецепторов с окаймленными ямками, неизвестны. Установлена первичная структура нескольких таких рецепторов, при этом никакого сходства между ними не выявлено. Все они имеют единственный трансмембранный сегмент, но у одних N_конец обращен в цитоплазму, а у других ориентирован в противоположном направлении. В нескольких случаях было показано, что цитоплазматический домен рецептора необходим для того, чтобы рецептор оставался в незамкнутых ямках, но об этом известно очень мало.

Судьбы рецептора и лнганда после их поглощения клеткой различаются. Исходя из этого можно выделить четыре основные группы систем лиганд-рецептор.

Группа I. Рецептор возвращается к поверхности клетки, лиганд направляется в лизосомы. Примерами служат ЛНП- и асиалоглико-протеиновый рецепторы.

Группа II. Как рецептор, так и лиганд направляются в лизосомы. Примерами являются ФРЭ- и инсулиновый рецепторы.

Группа III. Рецептор остается связанным с лигандом, а лиганд направляется в другой домен плазматической мембраны. Это явление называется трансцитозом и характерно для рецепторов иммуноглобулинов в поляризованных эпителиальных клетках. После такого клеточного «транзита» рецепторы для IgA и IgM подвергаются протеолитическому расщеплению, тогда как рецептор для IgG при некоторых условиях может использоваться вновь.

Группа IV. И рецептор, и лиганд возвращаются к одному и тому же домену плазматической мембраны. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода служит трансферриновая система, в которой после поглощения комплекса трансферрин-железо и удаления железа комплекс апотрансферрин-рецептор возвращается к клеточной поверхности.

Скорости всех этих процессов достаточно велики. Обычно время жизни рецепторов, возвращающихся к клеточной поверхности, составляет всего 3 - 6 мнн, а время полного оборота рецептора - около 15 - 25 мин. В равновесном состоянии на клеточной поверхности обнаруживается около 65 - 75% рецепторов, а остальная их часть находится на разных внутриклеточных мембранах. Полный анализ равновесной кинетики поглощения и процессинга может быть проделан с привлечением констант скоростей для каждого элементарного шага,

Одной из характерных особенностей механизма сортировки является его удивительная точность. Например, трансферриновый рецептор почти всегда находится в базолатеральной, но не в апикальной мембране поляризованных эпителиальных клеток. Вероятность его ошибочного включения в апикальную мембрану составляет лишь -0,1%, т. е. достаточно мала для сохранения полярности мембран этих клеток. В других системах, где по экспериментальным данным вероятность ошибки достигала 4%, для корректировки локализации рецепторов был необходим дополнительный этап сортировки.

Механизм сортировки должен быть весьма изощренным. По-видимому, различные комплексы рецептор-лиганд поглощаются вместе в одних и тех же частях окаймленных везикул, а сортировка внутри везикул происходит за несколько минут. Например, рецептор для асналогликопротеинов перемещается в латеральном направлении внутри эндосомной системы и концентрируется в трубочках и маленьких везикулярных компонентах, но не в крупных везикулах. Возможно, крупные эндосомные везикулы, практически лишенные этого рецептора, но содержащие гликопротеино-вый лиганд, сливаются затем с лизосомами. Однако трубочки, содержащие рецептор, возвращают его к клеточной поверхности. В этом случае сортировка несомненно происходит внутри эндосомного комплекса органелл.

Какой механизм лежит в основе быстрой сортировки макромолекул? Конечно, должны существовать особые структурные «сигналы», приводящие к компартмеитализации специфических рецепторов и лигандов. Единственным известным сигналом является ман-нозо_6_фосфат, который присутствует на ферментах, направляющихся в лизосомы. Маннозо_6_фосфатспецифичные рецепторы находятся в комплексе Гольджи, где они направляют новосинтезированные белки в лизосому, а также на плазматической мембране, где они вызывают секрецию таких ферментов во внешнюю среду.

Помимо специфических структурных сигналов сортировки большую роль играет закисление внутриклеточных везикулярных компартментов. Значение рН в эндоцитозных пузырьках составляет 5,0 - 6.2. При столь низких рН происходит диссоциация комплексов рецептор-лиганд, включающих липопротеины низкой плотности, лизосомные ферменты, асиалогликопротеины, фактор роста эпидермиса и инсулин. В таких условиях от комплекса трансферрин-рецептор отсоединяются и два атома железа, хотя в этом случае апотрансферрин остается связанным со своим рецептором.

У некоторых оппортунистических вирусов и токсинов выработались механизмы проникновения в клетку, основанные на закислении везикул. Например, дифтерийный токсин связывается с каким-то неидентифицированным рецептором на клеточной поверхности и затем поглощается эндоцитозным путем. Понижение рН эндоцитозных везикул индуцирует в молекулах токсина конформационное изменение, что приводит к его проникновению через везикулярную мембрану и позволяет ферментативно активной части токсина достичь цитоплазмы. рН-индуцируемое конформационное изменение может вызвать образование трансмембранной поры. Многие вирусы животных, имеющие оболочку, тоже попадают в цитоплазму путем эндоцитоза. Низкое значение рН, отмечаемое в эндоцитозных везикулах, индуцирует конформационное изменение в гликопротеинах, входящих в состав шиловидных структур вирусных мембран, что облегчает как слияние мембраны вируса с мембраной эндоцитозной везикулы, так и доставку вирусного генома в цитоплазму. Примерами могут служить вирус леса Семлики и вирус гриппа.

рН во внутриклеточных компартментах может повышаться при добавлении слабых оснований или ионофоров. Слабые основания могут проходить через липидный бислой в незаряженной форме и протонироваться в кислом содержимом компартмента. В результате рН в компартменте может повышаться на 1-2 единицы и блокировать многие рН-зависимые процессы. Такие слабые основания часто называют «лизосомотропны-ми» или «ацидотропными» агентами. Моненсин уравновешивает протонный и К+-градиенты, что также увеличивает рН в вакуолях.

Добавление этих агентов часто предотвращает рециклирование рецепторов клеточной поверхности. Комплексы рецептор-лиганд при этом не диссоциируют, и рецепторы накапливаются во внутренних мембранных везикулах, не достигая клеточной поверхности. Такая картина наблюдается, например, для ЛНП- и асиалоглико-протеинового рецепторов. По-видимому, обмен между периферическими эндосомами и плазматической мембраной при этом не ослабевает, однако миграция к лизосомам может блокироваться.

Большие успехи в изучении этой сложной системы сортировки были достигнуты благодаря применению электронной микроскопии при искусном использовании таких клеток, как пероксидаза хрена, а также рН-контролирующих меток. Весьма полезными оказались и генетические подходы, основанные на резистентности к определенным токсинам и вирусам при неполном закислении эндоцитозных везикул. Источником соответствующих мутантов могут быть дрожжи. Биохимические исследования основываются на выделении и характеристике хорошо известных субпопуляций эндоцитозных везикул. Для разделения эндоцитозных и экзоцитозных везикул используются специально разработанные электрофоретические методы, подходы, основанные на иммунологическом сродстве, а также процедуры со смещением плотности при использовании холинэстеразы. В некоторых лабораториях удалось провести слияние изолированных эндоцитозных пузырьков in vitro и показать, что для этого необходим АТР; слияние происходило только в случае эндоцитозных пузырьков, полученных в течение 5 - 15 мин после интерналнзации.

3.3 Клатрин

При эндоцитозе наблюдаются в первую очередь такие структуры, как окаймленные ямки и окаймленные везикулы. Их характерной особенностью является наличие на цитоплазматической поверхности полигональной решетки, образуемой клатрином. Свойства клатрина и ассоциированных с ним белков определяют, какие именно рецепторы скапливаются в окаймленных ямках; эти свойства каким-то образом опосредуют и изменение мембраны, приводящее к отшнуровыванию окаймленных везикул. Молекула клатрина содержит три тяжелые цепи и три легкие и имеет сложную структуру с тремя ветвями; каждая из ветвей образована одной тяжелой цепью и одной легкой. Выделенный клатрин спонтанно ассоциирует с образованием полигональной решетки как в присутствии, так и в отсутствие мембран. Работы по реконструкции с очищенными плазматическими мембранами показали, что в местах образования окаймленных ямок имеется ограниченное число участков связывания с высоким сродством к клатрину. С клатриновой решеткой связаны и вспомогательные белки с мол. массами 100 и 50 кДа.

Каждая клетка продуцирует два основных класса легких цепей клатрина. Они кодируются двумя разными генами, мРНК которых подвергается дифференциальному сплайсингу, что приводит к появлению по меньшей мере четырех разновидностей белков. Тяжелые цепи играют структурную роль, а легкие, вероятно, выполняют регуляторную функцию и содержат места связывания кальмодулина, а также АТР-зависимого раздевающего белка. В клетке половина клатрина находится в растворе, и между этой формой и мембранными структурами поддерживается динамическое равновесие. До слияния окаймленных везикул с эндоцитозной системой из них должен высвободиться клатрин; эта реакция катализируется раздевающим белком, который выполняет чисто каталитическую функцию, однако остается прочно связанным с молекулами клатрина даже в отсутствие клатриновой решетки. В клетке этот белок находится в избытке по отношению к клатрину.

Чтобы понять природу рецепторзависимого эндоцитоза и его регуляции, необходимо выяснить механизм перехода клатрина из мономерной формы в мембраносвязанную структуру и обратно, а также механизм образования таких структур на мембране.

3.4 Некоторые примеры интернализуемых рецепторов

Рассмотрим вкратце свойства некоторых рецепторов. Все они имеют единственный трансмембранный домен, но этим сходство и ограничивается. Мы остановимся на рецепторах групп I, III и IV.

ЛНП-рецептор человека

Это типичный рецептор группы I, который возвращается к плазматической мембране, в то время как его лиганд, сывороточный липопротеин низкой плотности, попадает в лизосому. Особенно богаты этим рецептором клетки печени и надпочечников, куда ЛНП поставляют холестерол для синтеза желчных кислот и стероидных гормонов соответственно. По данным об аминокислотной последовательности рецептора, определенной с помощью кДНК, он состоит из пяти доменов. Выраженная гомология с другими мембранными рецепторами отсутствует, хотя два самых крупных наружных домена содержат повторы, богатые цистеином и гомологичные соответственно фактору С9 комплемента и предшественнику ФРЭ. Рецептор имеет единственный трансмембранный домен и непротяженный цитоплазматический С-концевой домен. Показано, что у лиц с таким генетическим заболеванием, как семейная гиперхолестеролемия, ЛНП-рецепторы не функционируют. Установить функции структурных доменов рецепторов помог мутационный анализ. Так, было показано, что модификации в цитоплазматическом домене ЛНП-рецептора препятствуют связыванию рецептора с окаймленными ямками, даже если связывание ЛНП с рецептором не изменяется. Помимо выявления мутаций, происходящих in vivo, проводились опыты in vitro для получения необходимых мутаций и определения свойств экспрессированного продукта гена. Для этого применялась рекомбинантная ДНК, в которой отсутствовал ген, который кодирует домен, гомологичный предшественнику ФРЭ. Такой рецептор связывает ЛНП, но не высвобождает его при закислении. Это блокирует рециклирование рецептора и ведет к его деградации после связывания лиганда.

Страницы: 1, 2, 3, 4