Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

Гидролиз ДНК различными эндонуклеазами рестрикции проводили, согласно инструкциям фирм “СибЭнзим” (Россия) и “Fermentas” (Литва), используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим.

ДНК разделяли и визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, используя в зависимости от длины разделяемых ДНК 0.75% - 1%-ную агарозу и 1?ТВЕ буфер (табл. 3). Для оценки размеров фрагментов ДНК использовали ДНК-маркеры молекулярного веса “GeneRuler™ 100bp DNA Ladder” (“Fermentas”).

Очистка фрагментов ДНК.

Освобождение фрагментов ДНК от компонентов реакции проводили двумя способами: непосредственно из реакционной смеси или из агарозного геля после электрофореза.

Для этого к реакционной смеси или вырезанной полоске геля, содержащей нужный фрагмент ДНК, добавляли 5 объемов 5 М гуанидинтиоцианата, 0.1 М Tris-НС1 (рН 7.0) и 15 мкл суспензии кварцевого порошка “Silica” (100 мг/мл). При использовании полоски геля суспензию “Silica” добавляли после полного растворения геля. Полученную смесь центрифугировали 2 мин при 5000 об/мин. Осадок трижды промывали 750 мкл промывочного буфера (60% этанол, 80 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-НС1 рН 7.0) и высушивали. Элюцию ДНК проводили в 50 мкл буфера (10 мМ Tris-HCl, рН 8.5). В отдельных случаях фрагменты ДНК выделяли из агарозы и очищали с использованием набора “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (“Promega”, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Лигирование фрагментов ДНК.

Фрагменты ДНК после обработки соответствующей рестриктазой клонировали в вектор, раскрытый по тем же рестриктазам, либо ПЦР-фрагменты клонировали в вектор pZero-2, предварительно раскрытая по сайту EcorV .

Реакцию лигирования проводили в объеме 10 мкл, содержавшем 1?буфер для лигирования, 50-100 нг ДНК вектора и 3-5-кратный молярный избыток клонируемого фрагмента ДНК, 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (“СибЭнзим”). Лигирование по липким концам проводили в течение 4-16 ч при 14°С. По окончании реакции ДНК-лигазу инактивировали прогреванием при 70°С 15 мин. Лигазную смесь использовали для трансформации в клетки E. coli.

Лигирование в кольца фрагментов хромосомной ДНК. Фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, лигировали сами на себя в объеме 0.5 мл. Лигирование проводили при 16°С в течение ночи с разведениями субстратной ДНК 0.1-0.5 мкг/мл и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4. ДНК осаждали из лигазной смеси добавлением 2.5 объема этанола и 0.1 объёма 3М ацетата натрия, центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин, осадок промывали 80% и 96%-ным этанолом и растворяли в ТЕ-буфере. Полученную ДНК использовали в инвертированной ПЦР.

Получение компетентных клеток и их трансформация.

Получение компетентных клеток с применением CaCl2.Ночную культуру клеток (0.1 мл) вносили в 10 мл среды LB и выращивали при интенсивном перемешивании при 37°С до середины логарифмической фазы (А600= 0.4 - 0.6), охлаждали во льду 10 мин и центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин при 4°С). Осторожно удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 750 мкл 100 мМ СаСl2, выдерживали на ледяной бане 20 мин, центрифугировали в тех же условиях. После удаления супернатанта осажденные клетки ресуспендировали в 75 мкл 100 мМ СаСl2 и распределяли по 10 мкл в предварительно охлажденные пробирки. Полученные компетентные клетки использовали для трансформации сразу, либо после хранения при 4 °С не более 12-24 ч.

Трансформация компетентных клеток. К компетентным клеткам (10 мкл) добавляли лигазную смесь или раствор ДНК объемом 1-5 мкл, помещали пробирки в лед на 30 мин, а затем быстро переносили в водяную баню 42 °С на 2 мин и охлаждали во льду 10 мин. Добавляли в каждую пробирку 800 мкл среды LB и инкубировали при 37°С 1 ч. Клетки осаждали центрифугированием(14000 об/мин, 4°С, 15-30 сек), сливали надосадочную жидкость, ресуспендировали клетки в её остатках (50-100 мкл) и высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей антибиотики, необходимые для селекции трансформированных клонов.

Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook and Russell, 2001). 3-4 мл ночной культуры E. coli, содержащей плазмиду, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали в 250 мкл раствора I (табл. 8) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 250 мкл свежеприготовленного раствора II (табл. 8), осторожно перемешивали до полного просветления лизата. К лизату добавляли 250 мкл 3 М ацетата калия, перемешивали, оставляли во льду на 20 мин и центрифугировали (14000 об/мин, 30 мин) при 4 °С. Надосадочную жидкость переносили в пробирки, добавляли равный объем фенола, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали, водную фазу отбирали в новую пробирку. Добавляли равный объем смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали (14000 об/мин, 5 мин), водную фазу отбирали в новую пробирку. Затем добавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали (14500 об/мин, 5 мин). Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли 0.7 объема изопропанола, инкубировали в течение 0.5-1 ч при -20 ?С. После центрифугирования осадок последовательно промывали 70%- и 96%-ным этанолом, высушивали и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Добавляли РНКазу, свободную от ДНКазы, до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Затем в раствор добавляли 50 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1), центрифугировали (14500 об/мин, 5 мин), отбирали верхнюю фазу, добавляли равный объем хлороформа, повторно центрифугировали. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, приливали 2.5 объема этанола и 5 мкл 3 М ацетата натрия. Для полного осаждения плазмидной ДНК пробы выдерживали 10 мин при -20 °С и центрифугировали (14000 об/мин, 10 мин). Осадок дважды промывали 80% и 96%-ным этанолом и растворяли в 30 мкл воды. Выход плазмидной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле.

Создание праймеров и ПЦР.

Конструирование праймеров осуществляли с помощью программного пакета “VectorNTI®Advance v.9.0” и “OLIGO v.4.0”. Олигонуклеотиды синтезированы фирмой “Синтол” (Москва).

а) ПЦР с геномной ДНК проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 50-100 нг ДНК, по 0.2 мM каждого из четырёх дНТФ, 1?ПЦР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг/мл, 40 пмоль каждого праймера (табл. 10) и до 3 ед. Taq-ДНК-полимеразы (“СибЭнзим”). Цикл амплификации состоял из денатурации ДНК при 94 °С - 2 мин, последующие 30 циклов: денатурации 94 °С - 30 с, отжига праймеров при 46-54 °С (в зависимости от праймера) - 30 с, и элонгации ДНК при 72°С - 2 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72°С, 4 мин.

б) Инвертированная ПЦР.

Для этой реакции в качестве матрицы использовали фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, замкнутые в кольцо в предварительной реакции лигирования. Перед ПЦР полученную кольцевую ДНК прогревали 15 мин при 95 °С. В реакции использовали праймеры (по 20 пмоль каждый) и Taq-полимеразу, остальные компоненты реакции были те же, что в стандартной ПЦР. Реакцию (30 циклов) проводили в следующем режиме: при температура плавления 94 °С - 30 с; при температуре отжига 54 °С - 40 с; при температуре синтеза 72 °С - 4 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72 °С - 8 мин.

в) Векторетная ПЦР

Cтратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. Отжиг комплементарных последовательностей vect57 и vect53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Для стабилизизации полученного адаптера в реакционную смесь добавили MgCI2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре.

Для векторетной ПЦР хромосомную ДНК (10 нг) инкубировали в присутствии 20 ед. рестриктазы BamHI при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. Лигирование разрезанной хромасомной ДНК и адаптеров проводили в присутствии 50 ед. T4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask. Праймер C20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA.

г) Амплификацию генов биосинтеза эктоина из хромосомной ДНК (10 нг) проводили с использованием прямого и обратного праймеров (15 пмоль каждого) (табл. 10). Для амплификации полного гена ectA из M. marina использовали праймеры EAN и EAС, для гена ectB - ectBN и ectBC, для гена ectС - ectСN и ectСC и для гена ask - AskN и PET19Z или AskN и BglII. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего гены ectАВС, использовали праймеры Opr1 и Opr2. Реакцию проводили, используя смесь ДНК-полимераз Tag/Pfu в соотношении активностей 20:1. Остальные компоненты реакции были те же, что и в стандартной ПЦР.

Коньюгация.

Для коньюгации использовали штамм-донор E. coli S17-лpir, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL-180:Pmax:ectABC (полученной на основе рBSL-180). 10 мл ночной культуры E. coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “K”. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды “K”. В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AМ1. 50 мл культуры, выращенной до ОП600=0.4, центрифугировали и промывали средой “K”. Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды “K” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E. coli. Смесь переносили на агаризованную среду “К”, содержащую 0.2% Proteose peptone (“USBiological”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. После инкубации клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды “К”. Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде “К”, содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток E. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина.

4.6 Определение и анализ последовательностей нуклеотидов

Cеквенирование ДНК проводилось на фирме “Силекс” (Москва) с помощью “Big Dye Terminator Ready Reaction Kit” (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом ДНК секвенаторе “DNA Sequencer ABI PRISM 310” (“Applied Biosystems”, США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Использовали 0.3-0.5 мкг ПЦР-фрагмента и соответствующий праймер. Для определения полной последовательности нуклеотидов в ДНК фрагментах, длина которых превышала 1000 п.н., на основе полученных последовательностей конструировали новые праймеры. Эти праймеры использовали затем для реакций секвенирования.

Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, пакета программ VectorNTI®Advance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (v1.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы SEQBOOT, PROTPARS и CONSENSE (Felsenstein, 2004).

4.7 Клонирование и экспрессия гена ectA

Ген ectA, содержащий сайт для рестриктазы Nco при инициирующем кодоне и сайт на 3' конце фрагмента для HindIII, амплифицировали из геномной ДНК M. marina с использованием праймеров EctA(halN-N) и EctA(hal-C) (табл. 10). Фрагмент после обработки рестриктазами Nco и HindIII, содержащий ген ectA, лигировали в вектор pET28, с образованием вектора pETectA.

4.8 Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ?С до оптической плотности А600 = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-в-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3?0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni2+-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His6-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).

Гель-фильтрацию белка EctAhal1-His6, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5?90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).

4.9 Определение физико-химических свойств ферментов

Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.

При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ?С с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).

Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.

Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.

Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.

Результаты и обсуждение

Глава 5 Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерий Methylarcula marina

5.1 Накопление эктоина галотолерантным метилотрофом Methylarcula marina

Метанольные экстракты клеток галотолерантного метилотрофа Methylarcula marina анализировали методом ВЭЖХ на содержание эктоина. При увеличении солености среды в клетках M. marina возрастает содержание эктоина, причем максимальное содержание эктоина наблюдали при 8% NaCl (рис. 4). Рост M. marina замедляется при концентрации выше 6% NaCl. Снижение уровня эктоина в клетках, растущих при солености выше 8%, по-видимому, связано с накоплением других осмолитов.

Рис 4. Накопление эктоина клетками M. marina в ответ на солевой стресс NaCl, %

Следовательно, у M. marina эктоин является осмопротектором, т.е. соединением, ответственным за поддержание осмотического баланса между цитоплазмой и внешней средой. Далее представляло интересс изучить организацию генов биосинтеза данного осмолита у метилобактерии.

5.2 Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina

Для идентификации генов синтеза эктоина у M. marina был использован подход, основанный на ПЦР методологии. Проведенный ранне анализ опубликованных и представленных в GenBank данных свидетельствовал о том, что у исследованных видов галофильных и галотолерантных бактерий гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу, ДАБ-аминотрансферазу и эктоинсинтазу, расположены в одном кластере в последовательности ectABC. В результате сравнения аминокислотных последовательностей этих белков у галофильных гетеротрофных бактерий Marinococcus halofilus DSMт20408, Halomonas elongatа DSM 2581, Cromohalobacter salexigens (ранее Halomonas elongatа DSM 3043), Bacillus pasteurii, Vibrio cholerae, Bacillus haldurans, Oceanobacillus iheyensis (GenBnk AP004594), Streptomyces coelincolor (GenBank AL591322), а также ectABC кластеров у метилотрофных бактерий (Mm. alcaliphilium 20Z, Mm. kenyense AMO1, M. alcalica M8 и M. thalassica MT), и анализа найденных гомологичных участков были выбраны наиболее консервативные последовательности. С учётом вырожденности и встречаемости кодонов в генах, кодирующих эти белки, мы использовали ранее разработанные и созданные новые вырожденные праймеры для их амплификации (Рис. 5). При конструировании праймеров предполагалось, что у M. marina гены биосинтеза эктоина находятся в одном кластере и расположены последовательно: ectA, ectB и ectC (Рис. 5).

Страницы: 1, 2, 3, 4