Исследование соотношения в мышцах С- и Х-белков в норме и при патологии

Данные, полученные при исследовании свойств полифункциональных белков семейства тайтина в норме, при адаптации и заболеваниях дают основание предполагать, что изменения их структурно-функциональных характеристик может вносить вклад в развитие патологических процессов в мышцах. Выяснение роли тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка в патогенезе разных болезней является чрезвычайно актуальной задачей. В данной работе объектом нашего внимания являлись амилоидозы и, в частности, амилоидные свойства этих белков in vitro.

Глава 2. Амилоидозы

2.1. Актуальность проблемы

Амилоидозы - болезни, которые характеризуются отложениями нерастворимых фибрилл белка (амилоидных фибрилл) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков. Амилоидные отложения играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Дауна, диабет II типа, наследственная амилоидная полинейропатия, системные амилоидозы, прионные амилоидозы и др.) (Uversky & Fink, 2004). Однако, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно.

Амилоидоз широко распространен среди многих представителей животного мира. Описаны первичные (идиопатические), вторичные (приобретенные), наследственные и старческие его формы (Виноградова, 1980). Амилоидные отложения могут достигать килограммов (как, например, фибриллярные скопления лизоцима в печени). Они найдены также в сердечной мышце при кардиомиопатиях, миокардитах и в скелетных мышцах при миозитах (Барсуков и др., 2005). При миокардитах (воспалительное поражение сердечной мышцы) амилоид имеет вид россыпи. Возможно тотальное поражение сердца или только предсердий, только желудочков или клапанов. При кардиопатическом амилоидозе амилоид откладывается в эндо-, мио- и эпикарде. Отложения амилоида в сердце приводят к резкому увеличению его размеров (амилоидная кардиомегалия). Оно становиться очень плотным, миокард приобретает сальный вид ("резиновый миокард"). Миозит с включенными тельцами (амилоидами) сопровождается изнурительными мышечными болями. Амилоидные отложения обнаружены в скелетных мышцах, в миокарде, и по ходу межмышечной соединительной ткани, а также в стенках сосудов и нервах. Мышцы становятся плотными, полупрозрачными (Виноградова, 1980).

Уже сейчас амилоидозы - главная причина смерти после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. Диагностика большинства из них посмертная. Генезис этого заболевания, при котором возможно поражение любых органов и тканей и, следовательно, возникновение разнообразной клинической симптоматики, остается до конца не изученным. Возможно, причиной является спонтанное развитие амилоидоза, или наследственная передача болезни. Патогенез амилоидоза не уточнен, клинические проявления весьма пестрые и не всегда четко очерчены, лечение малоэффективно и редко диагностируется при жизни. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами.

2.2. История изучения амилоидозов

Первое описание амилоидоза у человека относится к XVII веку, когда Боне сообщил результаты наблюдения больного с абсцессом печени и громадной селезенкой, содержащей множество белых камней (саговая селезенка). Дальнейшую историю изучения амилоидоза можно разделить на три этапа. Начало первого этапа связано с именем венского патолога Рокитанского (1842 г.), открывшего "сальную болезнь", развивающуюся у больных туберкулезом, сифилисом, риккетсиозами. Позже, как выяснил Меккель (1853 г.), "сальная", или "холестериновая" болезнь обычно является второй болезнью и может поражать многие органы. В 1854 г. немецкий физиолог Вирхов на основании характерного прокрашивания патологических структур мозга йодом, решил, что образующиеся массы имеют углеводную природу - "подобны крахмалу" и ввел термин "амилоид", происходящий от латинского "амилум" и от греческого "амилон". Через несколько лет Фридрайх и Кекуле на основании химического анализа доказали белковую природу амилоидного вещества, однако термин "амилоид", "амилоидоз" сохранился до настоящего времени. Второй этап изучения амилоидоза относится к 20-м годам XX столетия, когда Бенхольд (1922 г.) предложил окраску амилоида Конго красным, обнаружив эффект двойного лучепреломления в поляризованном свете. Этот эффект указывает на тот факт, что амилоидные образования представляют собой упорядоченные микроскопические структуры. Данный метод впоследствии стал первым диагностическим тестом для определения амилоидов в клинической практике. В 1959 г. Коген и Калкинс с помощью электронной микроскопии установили, что все типы амилоида человека и экспериментальных животных имеют фибриллярную структуру (Sipe & Cohen, 2000). Амилоид оказался образованием, в котором фибриллярные белки связаны с полисахаридами и другими компонентами. Приблизительно с 60-х годов начался третий этап в изучении амилоидозов, совпавший с бурным развитием техники, в том числе и медицинской. Благодаря использованию электронной микроскопии, спектральных, иммунологических, химических, разнообразных клинических методов удалось получить много данных о природе и свойствах амилоида и его ультраструктуре. Было показано, что амилоидные отложения во многих органах человека и животных имеют сходную фибриллярную структуру: фибриллы 6-13 нм в диаметре и длиной 100 нм - 1.6 мкм. Фибрилла может состоять из двух и большего количества нитей (протофибрилл), соприкасающихся или перекручивающихся друг с другом (Shirahama & Cohen, 1967; Suzuki & Terry, 1967). С помощью рентгеноструктурного анализа и инфракрасной микроскопии показано, что для амилоидных фибрилл при всех известных вариантах амилоидоза характерна складчатая упаковка полипептидных цепей, именуемая в-складчатой структурой (Glenner et al., 1974).

2.3. Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл

Амилоидные отложения состоят из фибриллярных белков связанных с полисахаридами и другими компонентами. Физико-химические особенности амилоида определяют его тинкториальные свойства, выявляемые при использовании красителя Конго красного, тиофлавина Т или S.

Таким образом, термин "амилоидоз" объединяет болезни, которые характеризуются отложением белковых масс, имеющих фибриллярную ультраструктуру и обладающих двойным лучепреломлением в поляризованном свете. Значительный прогресс в выяснении структурных свойств амилоидных фибрилл был сделан с помощью рентгеновской дифракции фибриллярного материала, выделенного из биологических тканей, а также сформированного in vitro (Blake et al., 1996; Blake & Serpell, 1996; Sunde & Blake, 1997). Эти исследования показали, что все амилоидные фибриллы имеют в-складчатую структуру с отдельными в-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы. Это означает, что белок-предшественник амилоидов, не имеющий такой структуры, подвергается молекулярным перестройкам.

На сегодняшний день известно более 20 белков, образующих амилоидные фибриллы in vivo и участвующих в патогенезе амилоидозов (таблица 2), а также белки, амилоиды которых изучены только in vitro (таблица 3) (Uversky & Fink 2004). Ав-пептид, инсулин, лизоцим, транстиретин, амилин, хантингтин, тау-белок, б-синуклеин, миоглобин, и другие различаются между собой по аминокислотным последовательностям, вторичным и третичным структурам. Однако, несмотря на это, образованные ими амилоидные фибриллы имеют в-складчатую структуру. Эксперименты in vitro со многими белками показали, что перед образованием амилоидов структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа «б-спираль - в-складчатость», что, как правило, требует длительной инкубации и жестких условий, несовместимых с условиями in vivo: низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п., Белки-предшественники амилоидов могут иметь в-структуру, или б-спираль или содержать обе структуры. Переход растворимой формы прионного белка в фибриллярную сопровождается уменьшением содержания б-спирали и увеличением в-структуры. Ав-пептид при образовании амилоидных фибрилл также претерпевает трансформацию структуры от б-спирали к в-структуре. Все эти данные указывают на то, что белки, вторичная структура которых представлена б-спиралью, претерпевают трансформацию типа "б-спираль - в-структура" до или во время образования фибрилл. Однако процесс фибрилообразования не всегда требует перехода б-спирали в в-структуру. Так, белок транстиретин представляет собой тетрамер, где каждая субъединица содержит только в-структуру, а молекула б-синуклеина в нативной форме представляет собой развернутую структуру. К таким белкам можно отнести и исследуемые нами белки семейства тайтина, содержащие >90% в-cкладчатости.

Таблица 2.

Амилоидогенные белки и пептиды участвующие в патогенезе амилоидозов (см. ссылки в обзоре Uversky & Fink 2004).

Продолжение таблицы 2.

Таблица 3.

Амилоидогенные белки и пептиды, к настоящему времени не связанные с болезнями (см. ссылки в обзоре Uversky & Fink 2004).

Процесс олигомеризации и фибриллообразования происходит при взаимодействии молекул белка за счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий с образованием димеров - начальных строительных блоков (рис. 4). Например, значительный вклад в фибриллогенез Ав-пептида вносят гидрофобные взаимодействия. Дальше димеры олигомеризуются в тетрамеры, октамеры и т. д. с образованием протофибрилл шириной 2-3 нм и длиной до 200 нм. Эти образования накапливаются в лаг-фазе, характерной для кинетики фибриллообразования. Окончание лаг-фазы связано с образованием протофибриллами фибрилл диаметром 7-8 нм. События, происходящие в лаг-фазе, представляют большой интерес, так как именно на этой стадии с помощью микроскопа можно наблюдать кинетику фибриллогенеза, а также морфологию постепенно формирующихся агрегатов (т. е. динамику процесса) (Zerovnik, 2002). Причем, один и тот же белок может образовывать амилоидные агрегаты разной морфологии, т. е. обладать полиморфизмом, как например, Ав(1-40)-пептид, который образует зрелые структуры разного типа (рис. 5), такие как "ветвящиеся", "спиральные" и "ленточные" (Goldsbury et al., 2000). Полиморфизм был показан и для других белков, таких как амилин (Goldsbury et al., 1997), кальцитонин (Bauer et al., 1995), инсулин (Jimenez et al., 2002).

Рис. 4. Образование амилоидных фибрилл: (а) - нативная структура белка, (б) - промежуточное состояние, в котором части полипептидной цепи находятся в ненативной конформации, (в) - полностью развернутое состояние, (г) - образование межмолекулярного в-слоя, опосредованное развернутыми областями приводит к олигомеризации белка, (д) -дальнейшее образование в-складчатой структуры, (е) - образование протофибрилл, (ж) -формирование зрелых фибрилл (Jobansson, 2003).

Чемберлейн в 2000 г. показал, что фибриллы, образованные различными белками, обладают сходными структурными свойствами: все они образованы из протофибриллярных нитей, имеющих 2-5 нм в диаметре и содержащих от двух до пяти в-слоев. При этом размеры протофибрилл никак не связаны с количеством аминокислотных остатков белка-предшественника фибриллообразования. Так протофибриллы SH3 домена, включающего 90 аминокислотных остатков, состоят из двух в-слоев, а лизоцим, состоящий из 130 аминокислотных остатков, образует протофибриллярные нити, содержащие четыре в-слоя (Chamberlain et al., 2000).

2.4. Изучение амилоидных фибрилл in vitro

Первоначально, амилоидные фибриллы изучали, выделяя их из пораженных амилоидных отложений. В настоящее время для изучения амилоидных фибрилл, а также амилоидогенеза их формируют in vitro. Открытие того, что амилоидные фибриллы формируют не только белки, связанные с амилоидозами, значительно расширило эту область исследования (Dobson, 1999). Было показано, что при подходящих условиях образовывать амилоидные фибриллы in vitro могут многие белки, такие как лизоцим, миоглобин, Ав пептид, амилин, тау-белок, хангтингтин, мышечная ацилфосфатаза и др. (Uversky & Fink 2004).

Отмечено, что амилоидогенные белки обладают различными способностями к формированию амилоидов, что отражается также в различной скорости этого процесса. Например, мышечная ацилфосфатаза человека способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999) (рис. 6). Ав(1-40)-пептид после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты, и только после 48 часов - длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003), а образование фибрилл б-лактальбумина занимает несколько дней (Goers et al., 2002).

За скоростью амилоидогенеза наблюдают с помощью классического амилоидного красителя тиофлавина Т, который специфически взаимодействует с амилоидными фибриллами (Krebs et al., 2005). При взаимодействии тиофлавина Т с амилоидными фибриллами происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуорометрических измерениях и наблюдается желто-зеленая флуоресценция при флуоресцентно-микроскопических исследованиях. Молекула красителя состоит из бензтиазольного и аминобензольного колец свободно вращающихся вокруг общей С-С связи. Кребс и соавторы показали, что молекула тиофлавина Т связывается с амилоидными фибриллами специфически (Krebs et al., 2005). Они предположили, что связывание происходит в "каналах", которые тянутся вдоль в-слоев (рис. 7). Более того, тиофлавин Т связывается с амилоидными фибриллами так, что их молекулы параллельны друг другу и расположены вдоль длинной оси фибриллы (Krebs et. al., 2005). Было показано, что причиной возрастания интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с амилоидными фибриллами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы друг относительно друга в возбужденном состоянии (Воропай и др., 2003).

Другой амилоидный краситель Конго красный также специфически взаимодействует с амилоидными фибриллами (Klunk et al., 1989). Конго красный - сульфонированый азокраситель с гидрофобной центральной частью, состоящей из бифенильной группы, расположенной между отрицательно заряженными концами молекулы красителя (рис. 8). При связывании Конго красного с амилоидными фибриллами наблюдается зеленое двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, и это свойство делает Конго красный наиболее используемым красителем для диагностики амилоидов. В спектральных исследованиях регистрируется сдвиг спектра поглощения Конго красного в состоянии, связанном с амилоидными фибриллами, в длинноволновую область спектра, а именно от ~490 нм к ~500 нм.

Рис. 8. Модель связывания Конго красного с амилоидными фибриллами. Показан антипараллельный слой, где каждая пятая цепочка белка имеет одинаковое N-C направление. Поэтому, молекула Конго красного может связываться с таким же типом аминокислоты в обеих полипептидных цепях (первой и пятой, как указано на рисунке). Следующая молекула красителя сможет связаться с третьей и седьмой цепочкой и т.д. (Klunk et al., 1989).

Связывание амилоидных фибрилл с Конго красным зависит от структуры амилоидных фибрилл, а именно от наличия в-складчатой структуры с отдельными в-слоями. Кланк и соавторы предложили модель связывания амилоидных фибрилл с Конго красным посредством связей между двумя отрицательно заряженными сульфоновыми группами Конго красного и двумя положительно заряженными аминокислотными остатками двух отдельных белковых молекул, которые определенным образом ориентированы в в-складчатой структуре фибрилл, образованной посредством бок о бок расположенных отдельных молекул (Klunk et al., 1989). Это означает, что белковые цепочки расположены на расстоянии 4.7 Е. Более того, каждая пятая цепочка расположена от первой на расстоянии 19 Е. Это, приблизительно, соответствует расстоянию между сульфоновыми группами КК (рис. 8). Данная модель показывает специфичность взаимодействия Конго красного с амилоидными фибриллами.

2.5. Патологические проявления амилоидозов

К настоящему времени выделяют следующие формы амилоидозов (Мягкова, 2000):

первичный (идиопатический) амилоидоз - развивается вследствие невыясненных причин;

вторичный (приобретенный) амилоидоз - развивается как осложнение после хронических заболеваний, при которых происходит распад тканей (туберкулез, бронхоэктатическая болезнь, хронический остеомиелит и др.);

наследственный (генетический, семейный) амилоидоз - врожденное нарушение белкового обмена;

старческий амилоидоз.

С другой стороны, амилоидоз разделяют на системный и локальный. Однако классификация системного амилоидоза основана на специфичности основного амилоидного белка.

Внешний вид органов при амилоидозе зависит от степени развития процесса. Если амилоидные отложения небольшие, внешний вид органа изменяется мало и амилоидоз обнаруживается лишь при гистологическом исследовании. При выраженном амилоидозе орган увеличивается в объеме, становиться очень плотным и ломким, а на срезе имеет своеобразный восковидный или сальный вид.

До сих пор остается нерешенным вопрос, касающийся механизма действия амилоидных фибрилл на органы и ткани. Исследования последних лет показали, что амилоидные агрегаты разных белков и пептидов вызывают нарушение жизнедеятельности клеток и их гибель. Как оказалось, цитотоксические свойства проявляют все амилоидные белки (Hashimoto et al., 2003; Qahwash et al., 2003; Sirangelo et al., 2004; Lee et al., 2006), однако неизвестно, чем обусловлена цитотоксичность этих агрегатов - механическим повреждением клеток, связанным с накоплением амилоидных отложений или особым молекулярным механизмом их взаимодействий внутри клетки.

Страницы: 1, 2, 3, 4