Исследование роста микромицетов на различных источниках углеродного питания

Исследование роста микромицетов на различных источниках углеродного питания

35

1) определение радиальной скорости роста коллекционных микромицетов при росте на природных растительных материалов (растительный опад, камыш, сено, опилки, кора).

Практическая значимость работы заключается в том, что в настоящее время большой практический интерес вызывают микроорганизмы, в частности микроскопические грибы, участвующие в процессе деструкции природных растительных материалов.

1. Особенности использования углерода микромицетами

1.1 Использование углерода микроскопическими грибами

Соединения углерода используются грибами или как источники энергии, или же для синтеза важнейших составных частей клетки. Иногда на определенном этапе химических превращений оба эти процесса совпадают. Однако после образования некоторых промежуточных соединений, они обычно принимают различное направление. Определение общего количества усвоенного углерода не представляет больших затруднений. Значительные трудности встречаются, однако, при попытках проследить все химические превращения усвоенного соединения углерода в организме.

Баланс углерода. Общее представление о путях усвоения различных источников углерода может быть получено при определении количества выросшего мицелия, выделившейся углекислоты и других продуктов обмена веществ. Если первоначальное количество углерода известно, то его распределение в продуктах обмена веществ можно установить с помощью химических анализов. Обычно в этих опытах удается обнаружить 95 - 99% первоначального количества углерода.

Коэффициент использования. Связь между количеством продуктов обмена веществ, образованных грибов, и количеством использованного углеродистого или какого-либо другого соединения часто выражают математически, в виде отношения. Совершенно очевидно, что такого рода показатели (коэффициенты использования) представляют ценность лишь для данного вида гриба в определенных экспериментальных условиях. Иными словами, эти коэффициенты имеют абсолютное значение лишь для тех условий, в которых они были получены. Определение различных коэффициентов использования представляет не столь большую ценность, как установление полного баланса углерода, но зато оно требует значительно меньше химических анализов. Так как значение этих коэффициентов меняется в процессе развития гриба, то для получения более точных данных они должны определяться несколько раз, через различные интервалы времени после засева среды.

Наиболее широкое распространение из всех этих коэффициентов получил так называемый экономический коэффициент, выражающий соотношение между весом мицелия и спор и весом использованного сахара (или других источников углерода). Для этого по окончании опыта определяют оставшееся неусвоенным количество углерода в среде. Грибы, обладающие достаточной биохимической активностью, превращают приблизительно половину сахара, содержащегося в среде, в составные части клетки. Эффективность превращения веществ большинством грибов, культивируемых на лабораторных средах, значительно меньше. Это отчасти зависит от неправильного соотношения различных питательных веществ в среде и от характера углеродного обмена. Углерод, не использованный для синтеза мицелия, превращается в углекислоту и в промежуточные продукты обмена веществ, например спирт или органические кислоты. В промышленности стараются создать такие условия культивирования, при которых возможно большее количество углерода идет на образование нужного промежуточного продукта обмена и возможно меньшее количество расходуется на синтез мицелия и образование углекислоты.

Промежуточный обмен веществ. Усваиваемость различных источников углерода данным видом гриба определяется в основном структурой молекул этих соединений. Использование сложных природных соединений, например, полисахаридов, возможно лишь в том случае, если гриб способен синтезировать и выделять в среду необходимые гидролитические ферменты. Использование простых соединений, например, моносахаридов, также состоит из ряда следующих одна за другой ферментативных реакций обмена веществ. Известно, что химический состав гриба почти не зависит от использованного им источника углерода. Таким образом, на определенных этапах процесса синтеза различные исходные источники углерода превращаются в одинаковые соединения. Очень возможно, что эти исходные соединения углерода превращаются в одинаковые промежуточные продукты обмена веществ еще до начала синтеза (Капутто, 1949).

Промежуточные продукты обмена веществ должны, без сомнения, служить возможным источником углерода для гриба, который способен их образовывать. Если гриб превращает соединение А в соединение Б, то это последнее также должно служить возможным источником углерода для данного гриба. Неспособность гриба усваивать соединение Б указывает на то, что это соединение не является в действительности промежуточным продуктом обмена веществ. Однако в этой простой гипотезе не учитываются две следующие возможности: во-первых, соединение Б может проникать в клетку гриба не столь легко, как соединение А, и, во-вторых, соединение Б в испытываемых концентрациях может быть ядовито для гриба.

Нередко промежуточные продукты диссимиляции сахаров поступают в среду, из которой их можно затем выделить. Так, наличие ацетальдегида устанавливают, добавляя к среде бисульфит. Ацетальдегид образует с бисульфитом нерастворимое соединение. Иногда накопление определенного промежуточного продукта в среде обуславливается замедленным протеканием следующего этапа обмена веществ. В этих случаях промежуточные продукты обмена веществ, подвергаясь дальнейшим превращениям, со временем исчезают из среды. К таким промежуточным продуктам обмена веществ относятся ацетальдегид, этиловый спирт и пировиноградная кислота.

Нельзя утверждать, что усвоение сахара или какого-либо иного источника углерода происходит одинаково у всех видов грибов. Нет также никаких оснований предполагать, что у данного вида гриба существует лишь один путь усвоения углеводов. Nord F.F. и Mull R.P. (1945) считают, что диссимиляция углеводов различными видами Fusarium может происходить в результате окисления, в результате разрыва углеродной цепочки или, наконец, с участием реакций фосфорилирования. Относительная значимость этих трех процессов диссимиляции сахаров зависит от вида гриба и от внешних условий. Образование двумя различными видами грибов одинакового промежуточного продукта обмена веществ не является еще доказательством того, что в обоих случаях механизм образования этого продукта одинаков. Так, дрожжи и некоторые виды Fusarium образуют спирт, однако биохимические процессы, в результате которых эти микроорганизмы превращают глюкозу в спирт, различны (Лилли, 1957).

1.2 Использование микромицетами различных природных веществ в качестве единственного источника углерода

1.2.1 Разложение целлюлозы

Целлюлозолитические системы, состав и активность их отдельных компонентов, продуцируемые различными микроорганизмами, варьируют в широких пределах. В настоящее время наиболее перспективными продуцентами целлюлаз с точки зрения промышленного использования являются грибы следующих родов: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Physarium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticillium.

Среди грибов, способных расщеплять кристаллическую целлюлозу, только некоторые продуцируют полные внеклеточные целлюлолитические системы (эндо- и экзоглюканазы, ?-глюкозидазу). Среди них Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium funiculosum, Fusarium solani. Для культуральной жидкости большинства других грибов этой группы характерно отсутствие экзоглюканазы, то есть эти грибы могут деградировать более аморфные формы целлюлозы.

Деградация высокоупорядоченной формы целлюлозы осуществляется благодаря синергическому действию комплекса целлюлолитических ферментов. При любой комбинации экзо- и эндоглюканаз Trichoderma koningii, Fusarium solani, Penicillium и Funiculosum отмечается выраженный синергизм. Однако синергизм между экзоглюканазами этих грибов и эндоглюканазами грибов, не продуцирующих экзоглюканазу (Myrothecium verrucaria), не выявлен. Нет также синергизма между экзоглюканазами грибов и эндоглюканазами рубцовых бактерий. Последнее указывает на существенные различия целлюлолитических систем грибов и бактерий.

В природе в процессе фотосинтеза производится большое количество целлюлозы, в результате возникли многие виды целлюлолитических микроорганизмов. В почве целлюлозная и гемицеллюлозная части биомассы разлагаются интенсивнее, чем лигнин, и быстро метаболизируются почвенными микроорганизмами. Показано, что целлюлаза из Trichoderma viride образует с гуминовыми кислотами комплекс, стабильный в почвенных условиях. При внесении азота в почву разложение лигнина и целлюлозы ускоряется. Добавление глюкозы вызывает обратный эффект. Окончательный продукт деградации целлюлозы - углекислый газ, но если процесс протекает в анаэробной среде, образуется также метан (Марьиновская, 2006).

Содержание целлюлозы в древесном опаде составляет 34 - 59%, несколько меньше содержание гемицеллюлоз и пектина (Мирчинк, 1988).

Целлюлоза является линейным полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в молекуле клетчатки, как и в молекуле целлобиозы связаны ?-гликозидной связью. Поэтому клетчатку можно рассматривать как полимер целлобиозы. Norman A.G. и Fuller W.H. (1942) считают, что большинство грибов способно усваивать клетчатку. Несмотря на то, что использование клетчатки грибами имеет большое значение в круговороте веществ в природе, процесс этот изучен далеко не полно.

Campbell W.G. высказал предположение, что первым этапом использования клетчатки грибами является не гидролиз, а окисление. Гидролиз клетчатки можно схематически представить следующим образом клетчатка>целлодекстрины>целлотетроза>целлобиоза>d-глюкоза. Ферменты грибов, расщепляющие целлюлозу еще мало изучены.

Способность грибов усваивать клетчатку колеблется в очень широких пределах. В общем, усвоение клетчатки происходит медленнее, чем усвоение глюкозы. Это обуславливается, по всей вероятности, нерастворимостью клетчатки, в связи с которой действие целлюлазы ограничено поверхностью вещества. Возможно также, что синтез целлюлазы происходит сравнительно медленно (Лилли, 1957).

Основными источниками клетчатки для грибов в природных условиях служат древесина и различные растительные остатки. Хотя основной частью древесины и растительных остатков является именно клетчатка, тем не менее в них, помимо клетчатки, всегда содержатся гемицеллюлоза, камеди, таннины и лигнин. Грибы, разрушающие древесину, обычно подразделяют на виды, вызывающие белую гниль, и виды, вызывающие коричневую гниль. Грибы - возбудители коричневой гнили разрушают предпочтительно клетчатку. Грибы, разрушающие неклетчатковые составные части растительных тканей, вызывают белую гниль. Виды, относящиеся ко второй группе, по-видимому, значительно более многочисленны, чем виды грибов, вызывающие коричневую гниль. По данным Ноблеса М.К. (1948), к грибам, вызывающим белую гниль, относятся следующие виды: Armillaria mellea, Ganoderma lobatum, Lenzites betulinus, Pleurotus ostreatus, Polyporus abietinus, P. cinnabarinus, P. pargamenus. К немногим видам, вызывающим коричневую гниль, принадлежат: Daedalea quercina, Lentinus lepideus, Lenzites trabea, Merulius lacrymans и Trametes americana (Лилли, 1957).

1.2.2 Разложение крахмала

Как и целлюлоза, крахмал является полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в его молекуле соединены между собой ?-гликозидной связью, поэтому основной структурной единицей молекулы крахмала, как и молекулы гликогена, следует считать мальтозу. Крахмал состоит из двух различных соединений. Молекулы одного из них, называемого амилазой, имеют неразветвленную углеродную цепочку, тогда как другое соединение, с разветвленной углеродной цепочкой, получило название амилопектина. Зеленые растения синтезируют крахмал, животные и грибы образуют гликоген. Ферментативный гидролиз крахмала может быть схематически представлен следующим образом: крахмал>декстрины>мальтоза>d-глюкоза. Декстрины, имеющие разветвленную углеродную цепочку, лишь частично гидролизуются амилазой. Декстрины с неразветвленной углеродной цепочкой полностью превращаются в мальтозу (Мирбек, 1948).

Крахмал нерастворим в воде. Лишь грибы, образующие амилазу, обладают способностью усваивать крахмал. Существует немало грибов, неспособных развиваться на средах с крахмалом, однако большинство из них может усваивать этот полисахарид. Волконский (1934) установил, что 26 различных изученных им видов и штаммов оомицетов из числа сапролегниевых усваивали как крахмал, так и продукты его гидролиза (декстрины, мальтозу и глюкозу), но не были способны ассимилировать 13 других источников углерода, включая сюда и фруктозу. Позднее Марголин (1942) показал, что 19 из 21 вида грибов, усваивающих мальтозу, обладали также способностью использовать и декстрин (Лилли, 1957).

1.2.3 Разложение гемицеллюлоз

Гемицеллюлозы - полисахариды, сахара и уроновые кислоты - присутствуют во всех растительных тканях. Ксилан, относящийся к гемицеллюлозам, - полимер ксилозы, занимает по количеству в растениях второе место после целлюлозы. В древесине хвойных его 12%, лиственных деревьев - до 25%.

Разложение гемицеллюлоз - процесс неспецифический и осуществляется многими микроорганизмами. Большое место в этом процессе занимают грибы, в частности фермент ксиланаза есть у многих грибов, как микромицетов, так и высших базидиальных грибов, многие из которых являются типичными сапротрофами на растительном опаде (Мирчинк, 1988).

1.2.4 Разложение пектиновых веществ

Среди грибов имеются активные разлагатели пектина, который также является существенным компонентом растительного опада. Пектин образует в растениях межклеточное вещество, из которого состоят так называемые срединные пластинки, соединяющие между собой отдельные клетки растения. Они придают тканям прочность. Пектин представляет собой высокомолекулярное соединение углеводной природы - полисахарид, в котором метоксилированные остатки галактуроновой кислоты связаны между собой ?-1,4-глюкозидными связями.

В растениях пектиновые вещества присутствуют в виде нерастворимого протопектина в соединения с другими полисахаридами клеточной оболочки.

Действие пектиназ проявляется в размягчении ткани и распаде ее на отдельные клетки. Существует несколько типов ферментов-пектиназ в зависимости от специфики их воздействия на субстрат: протопектиназы вызывают превращение нерастворимого протопектина в растворимый протопектин, расщепляют связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанным с ней арабаном и ксиланом; пектинэстеразы гидролизуют метоксильные молекулы растворимого пектина (гидролитическое отщепление метоксильных групп от растворимого пектина), в результате чего образуется полигалактуроновая кислота и метиловый спирт; полигалактуроназы гидролизуют ?-1,4-глюкозидные связи пектиновой кислоты до свободных галактуроновых кислот. Встречаются главным образом у различных видов бактерий и грибов.

Многие грибы образуют пектинолитические ферменты. Высокая пектинолитическая активность обнаружена у некоторых эпифитных грибов, главным образом Aureobasidium pullulans и видов Cladosporium. Пектинолитические грибы занимают значительное место среди типичных представителей лесной подстилки - это виды родов Cladosporium, Alternaria, Aposphaeria, Penicillium, фитопатогенные грибы родов Fusarium, Verticillium, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum.

Ферментативное разрушение пектиновых веществ в растениях имеет значение в патогенезе некоторых заболеваний. Фитопатогенные грибы разрушают пектин срединной пластинкой и пектаты в первичных клеточных оболочках, что приводит к изменению их физико-химических свойств и создает условия для внедрения паразита, а также в результате действия пектинэстеразы образуются вещества - полигалактурониды, способные закупоривать сосуды, что в конечном итоге приводит к увяданию растений.

Существенное значение разрушения пектиновых веществ грибами имеет при разложении растительного опада. Практическое использование пектиназ грибов - применение в пищевой промышленности при приготовлении фруктовых соков для их осветления, а также при мочке льна (Мирчинк, 1988).

1.2.5 Разложение лигнина

Грибы - почти единственные разрушители лигнина. Способность грибов осуществлять глубокое разрушение лигнина представляет собой уникальное явление.

Лигнин - наиболее распространенное в природе полимерное циклическое соединение. В наибольшем количестве лигнин содержится в древесине и древесном опаде. Содержание его в опаде хвойных пород составляет 28 - 34%, лиственный пород - 18 - 28%. В химическом отношении лигнин не является индивидуальным веществом с вполне определенными свойствами и составом.

Исследования, касающиеся микробной деградации лигнина, относятся к одной из наиболее сложных биологических проблем, поскольку лигнин пока не может быть точно определен как химическое вещество. Также не могут быть точно определены и промежуточные реакции его биологического превращения. Наиболее активные группы микроорганизмов, разрушающих лигнин, принадлежат к древоразрушающим базидиомицетам, вызывающим белую гниль. Однако до настоящего времени неизвестны полностью все стадии ферментативных реакций в процессе разложения лигнина, то есть известны далеко не все ферменты, осуществляющие этот процесс.

Отличия деградации лигнина от деградации других полимеров заключается в том, что такие полимеры, как протеины, полисахариды, нуклеиновые кислоты, состоят из регулярно повторяющихся единиц, в то время как лигнин состоит из различных мономеров, имеющих различные типы связей. Большинство микроорганизмов, воздействующих на лигнин, вызывают в нем очень незначительные изменения, которые проявляются в основном в уменьшении числа метоксильных групп и очень слабой потере в весе. Некоторые сумчатые и несовершенные грибы могут расти на средах, содержащих препарат лигнина в качестве единственного источника углерода, такие, как Fusarium lactis, F. nivale и некоторые другие, но они не вызывают существенных изменений в молекуле лигнина. Вещества, представляющие собой производные лигнина, - ванилин, сиреневый альдегид и другие, используются грибами родов Chaetomella, Coniothyrium, Cylindrocarpon, Torula, Hormiscium.

Исследования последних лет показывают, что полное разложение лигнина с разрушением ароматического кольца могут осуществлять только базидиальные древоразрушающие грибы, вызывающие белую гниль: Coriolus versicolor, Fomes fomentarius, и некоторые подстилочные базидиомицеты, такие, как виды родов Collybria, Marasmius, Mycena.

Высокая молекулярная масса и низкая растворимость лигнина препятствуют его прямой ассимиляции микроорганизмами. Предварительно происходит его расщепление экзоферментами во внешней среде. Своеобразное химическое строение лигнина делает его труднодоступным для ферментных систем микроорганизмов. Многие микроорганизмы обладают ферментными системами, способными к превращению простых ароматических соединений. Однако полизамещенные ароматические соединения - мономеры лигнина - доступны лишь немногим представителям отдельных родов, так как для их разложения требуются весьма редкие у микроорганизмов ферменты деметилирования и декарбоксилирования ароматических структур. Необычен для микроорганизмов и характер связей между мономерами, некоторые из них не имеют аналогий среди соединений, типичных для живой клетки. Они совершенно недоступны для ферментов - деполимераз микроорганизмов, легко разрушающих белковые, полисахаридные, полинуклеиновые молекулы.

Способность многих грибов разлагать клетчатку и лигнин определяет их активное участие в разложении растительного опада. В растительном опаде в древесине лигнин и целлюлоза образуют природный комплекс, в котором его составляющие структурно и химически связаны между собой. Разложение лигноцеллюлозного комплекса грибами установлено серией экспериментов по разложению растительного опада, проведенных В.Я. Частухиным. Он разработал специальную методику для лабораторного изучения процессов распада, которая позволила создать модель процессов, происходящих в природе, в условиях точно контролируемых опытов.

По характеру воздействия на опад выделяют три группы подстилочных сапротрофов (Мирчинк, 1988):

I группа - грибы, преимущественно разлагающие клетчатку, - Lepiota procera.

II группа - грибы, преимущественно разлагающие лигнин, - Phallus impudicus.

III группа - грибы, осуществляющие смешанное воздействие, - Collybria, Marasmius, Clitocybe.

Г. Линдбергом были проведены опыты по определению интенсивности разложения целлюлозы и лигнина подстилочными сапротрофами, принадлежащими к различным видам Marasmius, непосредственно в растительном опаде с точным учетом исходного и конечного содержания этих продуктов в субстрате. Почти все виды Marasmius оказались способными разлагать лигнин, но интенсивность разложения лигнина у разных видов различна. Также было различным отношение количеств разложенных лигнина и клетчатки. Таким образом, внутри рода Marasmius можно выделить группы, преимущественно разлагающие лигнин, клетчатку или оба компонента вместе (Мирчинк, 1988).

Страницы: 1, 2