Исследование процесса физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде
/b> Так как данный штамм метилотрофных бактерий удалось адаптировать к 2Н2О, исследование принципиальной возможности использования гидролизатов его биомассы для культивирования других штаммов продуцентов представлялось весьма актуальным. Следует подчеркнуть, что усваиваемость биомассы метилотрофов клетками эукариот составляет 85-99%, а производительность метилотрофов, измеренная по уровню конверсии метилового спирта достигает 50% [29]. При этом учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать большое количество полноценных белков (до 55% от веса сухого вещества) [30], а также некоторое количество полисахаридов (до 10%) [31], причем эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих 2Н2О и [U-2H]метанол. Для выделения этих соединений из (2Н)меченой биомассы метилотрофных бактерий было необходимо проводить её гидролиз. Для этого использовали два метода гидролиза биомассы - щадящий гидролиз путём автоклавирования в 0.5 н. растворе 2HCl (в 2H2O) (30 мин, 08 ати) и исчерпывающий гидролиз биомассы в 6 н. 2HCl (в 2H2O) (24 часа, 110 0С). В предварительных экспериментах было показано, что по-первому варианту гидролиза биомассы реализуется гораздо большая питательность суспензии метилотрофных бактерий по сравнению с гидролизом в 6 н. 2HСl. Поэтому мы отдали предпочтение этому методу проведения гидролиза биомассы.Табл. 3Качественный и количественный состав аминокислот, выделенных из белковых гидролизатов B. methylicum
Аминокислота Содержание в белке, % от сух. веса 1 г биомассы протонированный гидролизат гидролизат, полученный 98%
2H2О и 2% [U-2Н ]метанола
Глицин
8.03
9.69
Аланин
12.95
13.98
Валин
3.54
3.74
Лейцин
8.62
7.33
Изолейцин
4.14
3.64
Фенилаланин
3.88
3.94
Тирозин
1.56
1.82
Аспарагиновая кислота
7.88
9.59
Глутаминовая кислота
11.68
10.38
Лизин
4.37
3.98
Гистидин
3.43
3.72
Треонин
4.81
5.51
Метионин
4.94
2.25
Аргинин
4.67
5.27
Вследствие того, что используемые в работе бактериальные штаммы были представлены их ауксотрофными по определенным аминокислотам формами, было необходимо оценить сколько данных аминокислот содержится в гидролизатах биомассы и каковы уровни их дейтерированности. В гидролизате биомассы, полученной с 2H2O-среды было зафиксировано небольшое снижение содержания лейцина, изолейцина, глутаминовой кислоты, лизина и метионина по сравнению с биомассой, полученной на обычной воде (табл. 3). Содержания аланина, аспарагиновой кислоты, треонина и аргинина в дейтерированном белке, напротив, немного превышают контрольные показатели, снятые в Н2О. Таким образом, достигнутый результат в опытах по адаптации B. methylicum к 2H2О, позволил использовать гидролизаты его (2Н)меченой биомассы, полученной в ходе многоступенчатой адаптации к 2H2О в качестве ростовых субстратов для выращивания бацилл Bacillus subtilis, а также штамма галофильных бактерий Halobacterium halobium. При этом, показателем, позволяющим надеяться на высокую эффективность включения дейтерия в продукты, синтезируемыми данными бактериальными штаммами, служит высокий уровень дейтерированности аминокислот суммарного белка этих бактерий, измеренный на метиловых эфирах DNS-производных аминокислот, за исключением лейцина и метаболически родственных с ним аминокислот, сниженные уровни дейтерированности которых объясняются эффектом ауксотрофности данного метилотрофного штамма влейцине (табл. 4).Табл. 4Уровни дейтерированности аминокислот суммарных белков B. methylicum, полученных в ходе многоступенчатой адаптации к 2H2O
Метиловые эфиры дансилпроизводных аминокислот
Величина молекулярного иона (М+)
Количество включенных атомов дейтерия
Уровень дейтерированности аминокислот, %
Dns-Gly-OMe
324.0
1.8
90.0
Dns-Ala-OMe
340.3
3.9
97.5
Dns-Val-OMe
368.5
4.0
50.0
Dns-Leu-OMe
(Dns-Ile-OMe)
383.4
4.9
49.0
Dns-Phe-OMe
419.6
7.6
95.0
Dns-Tyr-OMe
668.5
6.5
92.8
Dns-Ser-OMe
354.8
2.6
86.6
Dns-Thr-OMe
-
-
не определяли
Dns-Met-OMe
-
-
не определяли
Dns-Asp-OMe
396.4
2.0
66.6
Dns-Glu-OMe
411.0
3.5
70.0
Dns-Lys-OMe
632.4
5.3
58.9
Dns-Arg-OMe
-
-
не определяли
Dns-Нs-OMe
-
-
не определяли
Адаптация бацилл B. subtilis.В следующих опытах была исследована способность к росту на 2H2О бациллярного штамма B. subtilis, продуцента инозина. Рост данного штамма лучше всего происходил на ГС 1 среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а в качестве источника ростовых факторов гидролизаты (2Н)меченой биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum. Данный штамм удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдую агаризованную среду ГС 1 со 100% 2H2О. Он сразу обнаружил нормальный рост в присутствии 2Н2О. При культивировании адаптированного B. subtilis на жидкой ГС 1 среде, уровень накопления инозина в культуральной жидкости снижается по-сравнению с исходным штаммом. Например, при росте исходного штамма B. subtilis на среде, содержащей обычную воду и протонированную биомассу уровень накопления инозина в культуральной жидкости достигал величины 17 г/л после пяти суток культивирования (рис. 3). Вместе с тем уровень накопления инозина на ГС 1 среде, был снижен в 4.4 раза по сравнению с исходным штаммом на протонированной среде. Сниженный уровень продукции инозина на в этих условиях коррелирует со степенью конверсии глюкозы, которая на 2H2O ассимилировалась не полностью, о чём свидетельствовали значительные количества накопленной в культуральной жидкости глюкозы после ферментации. Поэтому было интересно оценить содержание глюкозы в гидролизатах биомассы B. subtilis. В состав гидролизатов внутриклеточных сахаров данного штамма входят глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза, мальтоза и сахароза (табл. 5). Важно, что содержание глюкозы в дейтерированной биомассе достигает 21.4%, т. е. значительно выше, чем для других сахаров. Содержания других сахаров в анализируемых образцах существенно не отличаются от таковых для Н2О, за исключением сахарозы, которая в дейтерированном образце не детектируется (табл. 5).Табл. 5Качественный и количественный состав сахаров, выделенных из гидролизатов биомассы B. subtilis.
Сахар Содержание в биомассе, в % от сухого веса 1 г биомассы протонированный гидролизат гидролизат, полученный
со 100% 2H2О
Глюкоза
20.01
21.40
Фруктоза
6.12
6.82
Рамноза
2.91
3.47
Арабиноза
3.26
3.69
Мальтоза
15.30
11.62
Сахароза
8.62
-
Адаптация галофильных бактерий H. halobium.В случае с H. halobium адаптацию проводили как на агаре, содержащим 100% 2H2О с добавлением гидролизатов (2Н)меченой биомассы B. methylicum, путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой ГС 2 среде. В обычных для этой культуры условиях культивирования (37 0С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина. Проведённые исследования подтвердили, что способность к адаптации к 2Н2O у разных родов и видов бактерий различная и может варьировать на примере метилотрофных бактерий в пределах даже одной таксономической группы. Из этого можно заключить, что адаптация к 2H2О определяется как таксономической специфичностью микрооорганизмов, так и особенностями их метаболизма, функционированием различных путей ассимиляции субстратов, а также эволюционной нисшей, которую занимает исследуемый объект. При этом чем ниже уровень эволюционного развития организма, тем лучше он приспосабливается к присутствию дейтерия в среде. Так, из изученных объектов самыми примитивными в эволюционном плане являются галофильные бактерии, относящиеся к археобактериям, практически не нуждающие в адаптации к 2Н2О, чего нельзя сказать о метилотрофных бактериях, которые труднее адаптируются к 2Н2О. Для всех изученных микроорганизмов рост на высокодейтерированных средах сопровождался снижением ростовых характеристик а также уровня продукции секретируемых БАС. Полученные для изученных микроорганизмов данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к 2H2О является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжелой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. По-видимому, метаболизм адаптированных клеток не претерпевает существенных изменений в 2H2O. В то же время эффект обратимости роста на 2H2O/Н2O- средах теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в Н2О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Однако, здесь необходимо подчеркнуть, что для проведения адаптации играет немаловажную роль состав среды культивирования. При этом не исключено, что при проведении адаптации на минимальных средах, содержащих 2Н2О образуются формы бактерий, ауксотрофные по определенным ростовым факторам, например аминокислотам, и вследствие этого бактериальный рост ингибируется. В то же время адаптация к 2Н2О происходит лучше всего именно на комплексных средах, содержащих широкий набор ростовых факторов и аминокислот, компенсирующих потребность бактерий в этих соединениях. Можно также предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы жизненно-важных систем в 2H2O. Так, например, нормальному биосинтезу и функционированию в 2H2О таких биологически активных соединений, как нуклеиновые кислоты и белки способствует поддержание их структуры посредством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах. Связи, сформированные атомами дейтерия различаются по прочности и энергии от аналогичных водородных связей [32]. Различия в нуклеарной массе атома водорода и дейтерия косвенно могут служить причиной различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить в свою очередь к структурным различиям и, следовательно, к функциональным изменениям в клетке. Вероятнее всего, что ферментативные функции и структура синтезируемых белков также изменяются при росте клеток на 2H2О, что может отразиться на процессах метаболизма и деления клетки. Некоторые исследователи сообщают, что после обратного изотопного (1Н-2H)-обмена ферменты не прекращают своей функции, но изменения в результате изотопного замещения за счет первичного и вторичного изотопных эффектов, а также действие 2H2О как растворителя (большая структурированность и вязкость по сравнению с Н2О) приводили к изменению скоростей и специфичности ферментативных реакций в 2H2O [33]. Структурно-динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава липидов, также могут изменяться в присутствии 2H2O. Так, сравнительный анализ липидного состава дейтерированных клеток B. subtilis, полученных при росте на 2H2O показал различия в количественном составе мембранных липидов по сравнению с Н2О (рис. 4). Примечательно, что в дейтерированном образце соединения, имеющие времена удерживания - 33.38; 33.74 и 33.2 мин не детектируются (рис. 4 б). Полученный результат, по видимому, объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, которая испытывает воздействие 2H2O, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) изменением количественного состава липидов. В общих чертах, при попадании клетки в дейтерированную среду из неё не только исчезает протонированная вода за счет реакции обмена Н2О - 2H2О, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-2H могут синтезироваться de novo [34]. Кроме вышеобозначенных эффектов, возможное изменение соотношения основных метаболитов в процессе адаптации к тяжелой воде также может негативно сказываться на рост клетки. Также не исключено, что эффекты, наблюдаемые при адаптации к 2H2О связаны с образованием в 2H2O конформаций молекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства. Так, по теории абсолютных скоростей разрыв С2H-связей может происходить быстрее, чем СH-связей, подвижность иона 2H+ меньше, чем подвижность Н+, константа ионизации 2H2О несколько меньше константы ионизации Н2О [35]. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что чувствительности различных клеточных систем к 2H2O отличны. С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене Н+ на 2H+ могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е., именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.
Нам представляется выбор бактерий в качестве модельных объектов для данных исследований наиболее целесообразным, так как прокариоты как организмы, стоящие на более низких ступенях развития живого, наиболее лабильны в генетическом аспекте и тем самым быстрее реагируют и приспосабливаются к изменчивым факторам среды. В заключение следует подчеркнуть, что для того чтобы сделать более конкретные выводы о природе и механизме адаптации клеток к тяжелой воде, необходимы экспериментальные данные по физиологии и биохимии адаптированных клеток.
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ
1. Young V. R., Yu Y. M., Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes 15N, 13C, and 2H as probes.: in New techniques in nutritional research, eds., H. R. G. Whitehead, A. J. Prentice, A. J.- Academic Press. - New York, 1990. - V. 9. - P. 17-72.
2. Harbison G. S., Smith S. O., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J., Herzfeld R., Mathies R., Griffin R. G. // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 2662-2667.
3. Ames J. B., Ros M., Raap J., Lugtenburg J., Mathies R. A. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 5328-5335.
4. Fischer M. R., de Groot H. J. M., Raap J., Winkel C., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 11038-11043.
5. LeMaster D. L., Richards F. M. // Anal. Biochem. - 1982. - V. 122. - P. 238-247.
6. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - P. 1-38.
7. Fesik S. W., Zuiderweg E. R. P.// Quarterly Reviewes of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 2. - P. 97-131.
8. Rothschild, K. J., Braiman, M. S., He, Yi-Wu., Marti, T., Khorana, H. G. // J. of Biol. Chem. - 1990. - V. 28. - P. 16985-16991.
9. Haris P. I., Robillard G. T., Vandijk A. A., Chapman D. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - N 27. - P. 6279-6284.
10. Argade, P. V., Rothschild, K. J., Kawamoto, A. H., Herzfeld, J., Herlihy, W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V. 78. - N 3. - P. 1643-1646.
11. Raap J., Winkel C., de Wit A. H. M., van Houten A. H. H., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Anal. Biochem. - 1990. - V. 191. - P. 9-18.
12. Karnaukhova, E. N., Reshetova, O. S., Semenov, S. Y., Skladnev, D. A., and Tsygankov, Y. D. // Amino Acids. - 1994. - V. 6. - P. 165-176.
13. Busujima U. K., Shimiba S., Narita K., Okada S. // Chem. Pharm. Bull. - 1988. - V. 36. - P. 1828-1832.
14. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. - 1993. - N 9. - С. 16-20.
15. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 3. - С. 3-12.
16. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 4. - С. 27-35.
17. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Ерёмин С. В., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 5. - С. 25-34.
18. Crespi H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd. // Ed. R. R. Muccino. - Elsevier. - Amsterdam, 1986 - P. 111-112.
19. Katz J, Crespi H.L. // Pure Appl. Chem. - 1972. - V.32. - P. 221-250.
20. Daboll H. F., Crespi H. L., Katz J. J. // Biotechnology and Bioengineering. - 1962. - V. 4. - P. 281-297.
21. Crespy H. L. Stable Isotopes in the Life Sciences. - International atomic energy agency. - Vienna. - 1977. - P. 111-121.
22. Кейл Б. Лабораторная техника органической химии. - М.: Мир, 1966. - С. 504.
23. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - V. 37. - N. 8. - P. 911-918.
24. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. // Органический анализ. - Л. Химия. - 1981. - С. 515-516.
25. Kletsova L. V., Chibisova E. S., Tsygankov Y. D. // Arch. Microbiol. - 1988. - V. 149. - P. 441-446.
26. Nesvera J., Patek M., Hochmannova J., Chibisova E., Serebrijski I., Tsygankov Y., Netrusov A. // Appl. Microb. Biotechnol. - 1991. - V. 35. - P. 777-780.
27. Ворошилова Э. Б., Гусятинер М. М., Жданова Н. И. // Биотехнология. - 1989. - N 2. - С. 137-141.
28. Максимова Н. П., Олехнович И. Н. Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у метилотрофных бактерий: Биохимия и физиология метилотрофов. - Пущино, 1987. - С. 77-85.
29. Colby J., Dalton H. // Ann. Rev. Microbiol. - 1979. - V. 33. - P. 481-517.
30. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. // Биоорганическая химия. - 1996. - Т. 22. - N 10-11. - С. 856-869.
31. Никонова Е. С., Доронина Н. В., Троценко Ю. А. // Приклад. биохим. и микробиол. - 1986. - Т. 22. - С. 557-561.
32. Barksdale A. D., Rosenberg A. // Methods Biochem. Anal. - 1982. - V. 28. - P. 1-25.
33. Tuchsen E., Woodward C. K. // J. Mol. Biol. - 1985. - V. 185. - P. 421-430.
34. Perrin C. L., Arrhenius G. M. L. // J. Am. Chem. Soc. - 1982. - V. 104. - P. 6693-6699.
35. Covington A. K., Robinson R. A., Bates R. G. // J. Phys. Chem. - 1966. - V. 70. - P. 3820-3829
О. V. МОSIN
Moscow State Academy of Fine Chemical Technology named after M. V. Lomonosov, 117571
The study of physiological adaptation process of bacteria to heavy water
The physiological adaptation process of various bacterial producents of amino acids, proteins and nucleosides belonging to various taxsonomic groups of microorganisms (facultative and obligate methylotrophic bacteria - Brevibacterium methylicum and Methylobacills flagellatum, halophilic bacterium - Halobacterium halobium and bacills - Bacillus subtilis) to growth and biosynthesis of necessary compounds on media containing the maximum concentration of heavy water is investigated. In article is informed on a method, which consists in multistep adaptation of bacteria to deuterium with the folowing selection of individual colonies grown on 2H2О. In the result of application of the given approach among the studied bacteria were selected the individual strains keeping high growth and biosynthetic abilities while growing on 2H2О. Data on growth and adaptation of studied bacterial strains on selective growth media, both minimum, and complex media, containing as a source of deuterium 2H2О/(2H)methanоl and (2H)biomass of methylotrophic bacteria B. methylicum, received during multistep adaptation to 2H2O are submitted.
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое.
