Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс

Молекула состоит из двух идентичных субъединиц. Максимальные размеры молекулы составляют 110?70?60А. Белок характеризуется высоким содержанием вторичной структуры; на долю б-спиралей, в-слоя и реверсивных поворотов приходится соответственно 47,13 и 9% аминокислотных остатков. Субъединицу аспартат-трансаминазы можно условно разделить на 3 части: большой домен, малый домен и переходные участки между ними. Большой домен образован остатками с 75 по 300; его основу составляет сильно изогнутый слой (в-слой), состоящий из 7 в-цепочек, окружённых б- спиралями. Большой домен является наиболее стабильной частью субъединицы, к нему присоединён пиридоксальфосфат. Малый домен состоит из тесно сближенных NH2 -и СООН - концевых участков полипептидной цепи, а именно из остатков с 15 по 50 и с 360 по 412. Из малого домена выходит NH2 - концевой фрагмент цепи, который пересекает вход в активный центр и затем вплотную прилегает к поверхности большого домена смежной субъединицы. Большой и малый домены связаны двумя переходными участками: с NH2 - конца - участком цепи, состоящим из остатков 300-360. Оба переходных участка образованы преимущественно - спиралями, лежащими на поверхности молекулы/29/.

Оба активных центра аспартат-трансаминазы расположены в глубоких впадинах на противоположных сторонах молекулы на границе между субъединицами. Стенки каждого из активных центров образованы большим и малым доменом одной субъединицы и краем большого домена другой смежной субъединицы. В состав активного центра входят аминокислотные остатки, принадлежащие обеим субъединицам; этим объясняется отсутствие каталитической активности у мономера, кофермент связан в глубине щели активного центра на расстоянии ~8-10 А° от поверхности молекулы. Сторона А пиридированого кольца обращена к в - слою и метильной группе остатка Тrp-140 (стороны пиридинового кольца обозначены в соответствии номенклатурой JUPAC). Угол между плоскостями пиридинового и индольного колец составляет ?40-45°, между кольцами возможно стэкинг-взаимодействие. Остаток пиридоксальфосфата связан альдиминной связью с е-NH2-группой лизина-258. Коферментами трансаминаз являются производные пиридоксина-пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат. Оба кофермента обратимо переходят друг в друга в ходе реакции переаминирования. Трансаминазы для катализа требуют оба кофермента, в отличие от других ферментов/13/.

1.2.3 Механизм реакции переаминирования

Общая теория пиридоксалевого капитализма была разработана в 1952 году А.Е. Браунштейном и М.М. Шемякиным, а несколько позднее - Д.Е.Мецлером и Э.Снеллом. Согласно этой теории действие пиридоксалевых ферментов обусловлено способностью альдегидной группы пиридоксальфосфата образовывать с аминокислотами альдимины (основания Шиффа) (рисунок1)/27/. В образующемся альдимине имеется система сопряженных двойных связей, по которой происходит смещение электронов от б - углеродного атома аминокислоты к электрофильному атому азота пиридинового кольца кофермента. Понижение электронной плотности у б- углеродного атома приводит к поляризации и ослаблению связей у этого атома.

Рисунок 1 - Смещение электронов к атому N кофермента.

Проведенные А.Е. Браунштейном и Э.Снеллом модельные эксперименты показали, что избирательный разрыв только одной из этих связей с образованием карбаниона, определяется особенностями строения активного центра фермента. Эти представления получили подтверждения при исследовании очищенных фосфопиридоксалевых ферментов. В 1966 году Донатан выдвинул и теоретически обосновал важное положение о том, что в альдимине, фиксированном в активном центре фермента, должна разрываться та из связей у б - углеродного атома, которая ориентирована перпендикулярно к плоскости пиридинового кольца пиридоксальфосфата. При такой ориентации энергия, необходимая для разрыва связи, минимальная вследствие перекрывания электронной орбитали связи с сопряженной р - системой кофермента ( у - р - перекрывание). Донатан предположил, что конформация может контролироваться апоферментом, возможно с помощью связывания карбоксилат - иона, а также, что имин может принимать одну из трех возможных конформаций/29/.

Здесь прямоугольником обозначена плоскость пиридинового кольца, вертикальной линией изображена у - связь. Конформамация (1) благоприятствует переаминированию.

Методами спектрального анализа было установлено, что альдегидная группа связанного в активном центре пиридоксальфосфата образует так называемое “внутреннее” основание Шиффа с е- NH2 - группой остатка лизина в белке. Из этого следует, что на начальном этапе каталитической реакции б - аминогруппа субстрата вытесняет е- NH2 - группу лизина из связи с коферментом (стадия трансальдиминирования). На основании изучения спектральных, химических и кинетических свойств аспартат - трансаминазы был сделан вывод о том, что как прямая, так и обратная реакция переаминирования состоят из восьми стадий; интермедиаты, возникающие на этих стадиях, представлены на рисунке 2/27,28/.

На первом стадии происходит присоединение к ферменту субстратной аминокислоты с образованием нековалентного комплекса Михаэлиса. Далее один из протоков аминогруппы субстрата переходит на атом азота внутренней иминной связи (стадия 2); в результате аминогруппа приобретает нуклеофильные свойства, необходимые для атаки на атом С-4' кофермента. Эта атака приводит к образованию промежуточного тетраэдрического соединения (геминального диамина, стадия 3); за этим следует освобождение е- NH2 - группы остатка лизина из связи с пиридоксальфосфатом и возникновение "внешнего" или субстратного альдимина (стадия 5), одной из форм которого является хинолоид показанный на рис.2. Последующее протонирование атома С-4' дает кетимин (стадия 6), при гидролизе которого образуется ПМФ - форма фермента и оксокислота (стадии 7 и 8). Далее реакция идет в обратном направлении между ПМФ - формой трансаминазы и другой ококислотой и приводит к регенерации ПЛФ - формы ("внутреннего" альдимина) и образованию новой аминокислоты.

Таким образом, реакции переаминирования являются обратимыми и универсальными для всех живых организмов. Пиридоксальфосфат в этих реакциях выполняет роль переносчика аминогруппы и в конечной стадии освобождается и может вновь вступить в ферментативный процесс.

Рисунок 2 - Основные интермедиаты, образующиеся в ходе реакции переаминирования.

а - внутренний альдимин;

б - нековалентный комплекс Михаэлиса;

в - то же, что у, но атом иминного азота протонирован;

г- геминальный диамин;

д- внешний альдимии;

е - хинолоид;

ж - кетимин;

з - карбиноламин;

и- пиридоксаминфосфат.

1.2.4 Биологическая роль трансаминаз

Аминокислоты, не использованные для синтеза белков и других производных, не накапливаются в организме в больших количествах. Они подвергаются различным ферментативным превращениям и, в конечном счете, распаду /32/. Важную роль в азотистом обмене играют процессы перехода одних аминокислот на другие, в результате ферментативных реакций переаминирования. При этом происходит обратимый перенос NH2 - группы от L - аминокислоты на L - кетокислоту без промежуточного образования аммиака. Таким образом, в реакции переаминирования участвуют L - аминокислота как донор и L - кетокислота как акцептор аминогруппы. Эти реакции катализируются особыми ферментами трансаминазами. Коферментом трансаминаз является пиридоксаль - 5Ч - фосфат, который и является промежуточным переносчиком аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту/27/.

Широкое распространение трансаминаз в животных тканях, у микроорганизмов и растений, их высокая резистентность к физическим, химическим и биологическим факторам, абсолютная стереохимическая специфичность по отношению к L - и Д - аминокислотам, высокая каталитическая активность в процессах переаминирования послужили предметом детального исследования роли этих ферментов в обмене аминокислот/33/. Тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно Международной классификации трансаминазы относят к 2 классу трансфераз, 4 подклассу - аминотрансферазы; наименование их составляется по форме «донор - транспортируемая группа - трансфераза» /34/. А. Е. Браунштейн выдвинул гипотезу о возможности существования в живых тканях не прямого пути дезаминирования аминокислот через реакции переаминирования, названного им трансдезаминированием. Основой для этой гипотезы послужили данные о том, что из всех природных аминокислот в животных тканях с высокой скоростью дезаминируются только L - глутаминовая кислота. Согласно этой теории большинство природных аминокислот сначала реагируют с L - кетоглутаровой кислотой в реакции переаминирования с образованием глутаминовой кислоты к соответствующей кетокислоте/30/. Образовавшаяся глутаминовая кислота подвергается окислительному дезаминированию под действием глутаматдегидрогеназы. Механизм трансдезаминирования можно представить в виде следующей схемы /13/:

R1- CH (NH2)-COOH L-кетоглутарат НАДН2 + NH3

R1- CO- COOH L-глутамат НАД + Н2О

трансаминаза глутаматдегидрогеназа

Обе реакции (переаминирование и дезаминирование глутаминовой кислоты) являются обратимыми, создаются условия для синтеза любой аминокислоты, если в организме имеются соответствующие L - кетокислоты. Организм животных и человека не обладает способностью синтеза углеводородного скелета (L - кетокислот) так называемых незаменимых аминокислот, этой способностью обладают только растения и многие микроорганизмы.

В живых организмах осуществляется синтез природных аминокислот из L - кетокислот и аммиака, этот процесс был назван А. Е. Браунштейном трансреаминированием. Сущность его сводится к восстановительному аминированию L - кетоглутаровой кислоты, с образованием глутаминовой кислоты, и к последующему переаминированию глутамата с любой L - кетокислотой. В результате образуется L - аминокислота, соответствующая исходной кетокислоте, и вновь освобождается L - кетоглутаровая кислота, которая может акцептировать новую молекулу аммиака/35/.Схематически роль трансаминаз в дезаминировании в биосинтезе аминокислот можно представить в следующем виде/28/:

 L-Аминокислота Пиридоксальфосфат L-Глутамат НАД

R1-CH(NH2)-COOH O=CH-ПФ HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH НАДФ

Трансаминаза НАДФН2

R1-C-COOH H2N-CH2-ПФ HOOC-(CH2)2-C(NH)-COOH НАДН2

L-кетокислота Иминоглутарат

Пиридоксаминфосфат Н2О

HOOC-(CH2)-C-COOH

L-кетоглутарат NH3

Схема показывает, что трансаминаза катализирует опосредованно через глутаматдегидрогеназу как дезаминирование природных аминокислот (стрелки вниз), так и биосинтез аминокислот (стрелки вверх).

Путем переаминирования большинство аминокислот может превращаться одна в другую или заменяться соответствующей кетокислотой. Поэтому реакции переаминирования - один из важнейших процессов при биосинтезе заменимых аминокислот. Особенно легко переаминируются глутаминовая и аспарагиновая кислоты, так как соответствующие им трансаминазы имеют очень высокую активность. Кетокислоты, получаемые из этих аминокислот (L - кетоглутаровая и щавелевоуксусная кислоты), осуществляют связь углеродного и белкового обмена /36/.

Таким образом, трансаминазы играют важную роль в азотистом обмене, участвуют в биосинтезе аминокислот. Биологический смысл реакций переаминирования аминокислот состоит в том, чтобы объединить аминогруппы распадающихся аминокислот в составе молекул одного типа аминокислоты, а именно глутаминовой /31/.

Трансаминазы относятся к универсально-распространенным ферментам. В тканях различных органов содержится значительное количество трансаминаз, в сотни и тысячи раз превышающее уровень активности их в сыворотке крови. При электрофорезе они мигрируют с L - и г - глобулинами. Особенно высокой активностью АСТ (КФ.2.6.1.1.) отличаются сердце, печень, мышечная ткань, почки, поджелудочная железа (перечень представлен в порядке убывания активности АСТ). АЛТ (КФ.2.6.1.2.) в наибольших количествах обнаруживается в печени, в связи с этим ее называют печеночной трансаминазой, затем в поджелудочной железе, сердце, скелетных мышцах.

Значительные различия в активности трансаминаз в отдельных органах и в сыворотке крови определяют его важное клиническое диагностическое значение, так как при поражении ткани возникает резкий скачок уровня активности трансаминаз в крови. Наибольшее значение представляет повышение активности АСТ при инфаркте миокарда. Степень повышения отражает массовость поражения сердечной мышцы и тяжесть инфаркта. Характерна динамика активности АСТ при инфаркте миокарда: начало подъема - через несколько часов после возникновения заболевания, максимальный подъем - к концу первых суток, нормализация возможна в течение первой недели болезни. При других заболеваниях сердца повышение активности АСТ либо не происходит, либо носит умеренный характер. Однако активность АСТ повышается и при поражении других органов и тканей. Многие авторы склонны рассматривать определение АСТ как ценный тест при проведении дифференциальной диагностики между инфарктами сердца и легких. Основанием к этому служит значительно более высокая (в 50 раз) активность фермента в мышце сердца, в сравнении с тканью легкого. Активность трансаминаз в сыворотке крови является одной из наиболее ценных и самым распространенным в клинической практике показателем поражения печени, характеризующие протекающие в ней цитолитические процессы /37/.

Повышение активности аминотрансфераз, и, прежде всего АЛТ, выявляется уже в ранний, инкубационный, преджелтушный период вирусного гепатита, что имеет принципиальное эпидемиологическое значение для выявления больного еще до появления желтухи. В результате значительного повышения активности АЛТ у больных вирусным гепатитом снижается коэффициент Де Ритиса (АСТ: АЛТ) ниже 1 при норме 1 - 3, а при остром инфаркте миокарда, напротив, резкое возрастание этого коэффициента /38/.

При хронических гепатитах и циррозах печени соотношение трансаминаз меняется, и коэффициент повышается выше нормы. Важно иметь в виду, что механические желтухи (непроходимость желчных протоков в связи с желчекаменой болезнью или опухолью) не сопровождаются выраженным повышением трансаминазной активности. Возможно повышение активности трансаминаз при воспалительных заболеваниях различных органов и тканей, при мышечных дистрофиях и т. д. /37,38/.

Таким образом, в настоящее время установлено, что переаминирование является весьма важным и распространенным процессом биологического распада и синтеза аминокислот; он протекает в различных тканях животных, растений и в микроорганизмах. Поэтому исследование этого процесса имеет большое фундаментальное и прикладное значение.

2. Материалы и методы

2.1 Экспериментальная часть

2.1.1 Экспериментальные животные

Эксперимент проводился на самках белых беспородных крыс средней массы 250-300 г. Животные подвергались токсическому действию азотнокислого кадмия (Cd(NO3)2) во время лактации. Введение нитрата кадмия производилось самкам per os в течение 10 дней (с 1 по 10 день после рождения потомства) в дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг /39/. По достижении потомством экспериментальных животных четырехмесячного возраста их декапитировали и производили отбор органов и тканей для определения активности АСТ и АЛТ.

В качестве контроля использовали животных, которым в период лактации вводили в соответствующем объеме физиологический раствор.

2.1.2 Подготовка биологического материала

2.1.2.1 Подготовка сыворотки крови

После декапитации животных кровь собирали в гепаринизированные пробирки и для получения сыворотки подвергают центрифугированию, при 3000 об/мин, в течение 15 минут. После центрифугирования получали сыворотку, не содержащую форменных элементов крови. Затем отбирали сыворотку в пробирки, и производили определение активности АСТ и АЛТ методом Райтмана - Френкеля/40/ с помощью стандартных наборов реактивов.

2.1.2.2 Подготовка гомогенатов тканей и органов

Извлеченные органы (печень, головной мозг, сердце, почки) отмывали от крови физиологическим раствором, взвешивали 1-2 грамма ткани, измельчали ножницами и растирали в ступке. Все операции производили на холоду. Затем добавляли среду выделения (0,005 N Tris, 0,1 N KСl, pH7,4) в отношении 1: 50 для головного мозга, сердца и почек, и 1:100 - для печени. Полученные гомогенаты переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 4500 об/мин 10 минут. После центрифугирования супернатант переносили в другие пробирки, а осадок выбрасывали. Далее в супернатанте производили определение активности АСТ и АЛТ методом Райтмана - Френкеля /40/ при помощи стандартных наборов реактивов.

2.2. Определение активности аминотрансфераз методом Райтмана - Френкеля

АСТ в присутствии L - кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L - -аспартата с образованием оксалоацетата, который декарбоксилируется до пирувата /41/:

L - кетоглутарат + L - аспартат > L - глутамат + оксалоацетат > ПВК

АЛТ в присутствии L - кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L - аланина с образованием пирувата /41/:

L - кетоглутарат + L - аланин > L - глутамат + ПВК

Пируват с 2,4 - динитрофенилгидразином (2,4 - ДНФГ) в щелочной среде образует окрашенный гидразон, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна активности АСТ и АЛТ.

2.2.1 Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови

В обычные пробирки наливали 0,5 мл субстрата (L - аспартат (L - аланин) 0,1 моль/л, L - кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови. Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли сыворотку. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа - АСТ и 30 минут - АЛТ при 37С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам приливали по 0,5 мл раствора 2,4 - ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 - ДНФГ приливали 0,1 мл сыворотки крови. Через 20 минут (20-25 оС) в пробирки приливали по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH, хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt 537нм) в кюветах толщиной 1см.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: каталитическая концентрация АСТ(АЛТ)= (Епр - Ек)К, где К - коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр - экстинция пробы, Ек - экстинция контроля.

Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мл стандартного раствора пирувата. К пробам, содержащим от 0,5 до 0,25 мл субстрата (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пирувата), добавляли 0,5мл раствора 2,4 - ДНФГ, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1. Калибровочный график строили, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс - соответствующие им значения активности АСТ и АЛТ.

2.2.2 Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в гомогенатах органов

В пробирки наливали 0,1 мл разбавленного гомогената тканей печени, головного мозга, сердца, почек и 0,5 мл субстрата (субстрат предварительно нагревали на водяной бане до 37 оС). Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли субстрата. Пробы хорошо перемешивали и инкубировали в течение 1 часа при 37 о С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам прибавляли по 0,5 мл раствора 2,4 - ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 - ДНФГ приливали 0,5 субстрата. Пробы оставляли на 20 минут при комнатной температуре, затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, тщательно перемешивали и через 30 минут измеряли оптическую плотность при 505 нм, в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Расчет активности ферментов в гомогенатах органов производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: АСТ(АЛТ) = (Епр- Ек)К, где К - коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр - экстинция пробы, Ек - экстинция контроля.

Калибровочный график для определения аминотрансфераз в гомогенатах тканей строили так же, как для сыворотки крови. Для расчета активности ферментов учитывали все разведения гомогената и выражали в пересчете на 1 грамм ткани (мг белка).

Все экспериментальные группы содержали от 7 до 9 животных, полученные данные были подвергнуты статистической обработке. Достоверность различий между группами оценивали с учетом критерия Стюдента, в соответствии с общепринятой методикой /42/.

Результаты и обсуждение

Трансаминазы являются важнейшими ферментами обмена веществ. Аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) - близкие по действию ферменты, при участии которых в организме человека осуществляется межмолекулярный перенос аминогрупп с аминокислот на кетокислоты. Этот процесс - трансаминирование - ответственен за синтез и разрушение отдельных аминокислот в организме. В процессе переаминирования, осуществляют связь углеродного и белкового обмена /36/. В связи с этим, изучение влияния ионов кадмия как распространенного экотоксиканта, принадлежащего к группе тяжелых металлов, представляет несомненный интерес.

В ходе исследования активности аланинаминотрансферазы (КФ.2.6.1.2.) и аспартатаминотрансферазы (КФ.2.6.1.1.) были получены следующие результаты.

Таблица 1- Активность аланинтрансаминазы в сыворотке крови и гомогенатах органов 4-х месячных самок крыс подвергшихся хроническому действию кадмия в неонатальный период

В результате эксперимента было установлено снижение активности АЛТ в гомогенате печени в выбранных дозах в 2 раза (р<0,003) по отношению к контролю, как показано в таблице1 и на рисунке Б.1.

У самок опытной группы в сыворотке крови происходило увеличение достоверное увеличение активности АЛТ в группе 0,5 мг/кг в 2,7р (р<0.02) и в группе 2 мг/кг в 3 раза (р<0,001) таблица 1, рисунок А.1.

В гомогенате мозга нами не было выявлено достоверных различий в изменении активности АЛТ, хотя наблюдалась тенденция к её снижению, что отражено в таблице 1 и на рисунке В.1.

В гомогенате почек при дозе 0,5 мг/кг активность АЛТ уменьшилась в 2,5 раза (р<0,004) по отношению к контролю, а при дозе 2 мг/кг по отношению контролю уменьшилась более, чем в 3 раза (р<0,005) (таблица1,рисунок Д.1). Статистически достоверных различий в активности фермента между дозой 0,5 мг/кг и 2 мг/кг выявлено не было.

В гомогенате сердца достоверных изменений активности АЛТ в дозах как 0,5 мг/кг, так и 2 мг/кг не наблюдалось (таблица 1 Приложение Г.1).

В работе также было изучено изменение активности аспартатаминотрансферазы у потомства белых крыс, подвергшихся токсическому действию солей кадмия в период лактации.

Активность АСТ в гомогенате печени при дозе 0,5 мг/кг по сравнению с контролем достоверно не изменилась, тогда как при дозе 2 мг/кг - повысилась более чем в 2,5 раза (р<0,03) таблица 2, приложение Б.2.

При введении экспериментальным животным нитрата кадмия в дозе 0,5 мг/кг, у их потомства не наблюдалось статистически достоверного изменения активности АСТ в сыворотке крови по сравнению с контролем. При дозе 2 мг/кг отмечено уменьшение активности АСТ сыворотке примерно 6 раз (р<0,05) по сравнению с контролем. Полученные данные представлены в таблице 2, рисунке А.2.

Таблица 2-Активность аспартаттрансаминазы в сыворотке крови и гомогенатах органов 4-х месячных самок крыс подвергшихся хроническому действию кадмия в неонатальный период

В таблице 2, рисунке В.2 показано, что гомогенате мозга при дозе 0,5 мг/кг активность АСТ достоверно не изменилась (р<0,84) по сравнению с контролем. Введение лактирующим крысам нитрата кадмия в дозе 2 мг/кг привело к увеличению активности АСТ в гомогенате мозга потомства почти в 2 раза (р <0,05) по отношению к контролю.

При изучении токсического действия ионов кадмия на потомство белых крыс было обнаружено, что в гомогенате почек при дозе 0,5 мг/кг активность АСТ по сравнению с контролем достоверно не изменялась (р<0,68) (таблица 2, рисунок Д.2). При дозе 2 мг/кг активность АСТ увеличилась 2,3 раз (р<0,02 по сравнению с контролем) (таблица2, рисунок Д.2).

Определение активности аспартатаминотрансферазы в гомогенате сердца показало увеличение активности 1,4 раза (р<0,02) по сравнению с контрольными значениями при дозе 0,5 мг/кг. Увеличение дозы токсиканта до 2 мг/кг не приводило к статистически достоверным изменениям активности фермента по отношению к контролю таблица 2, рисунок Г.2.

Полученные в результате эксперимента данные можно объяснить следующим образом: Печень и почки являются органами мишенями при кадмиевой интоксикации выявленное уменьшение активности АЛТ в гомогенате печени можно объяснить тем что, кадмий повреждает клетки печени (гепатоциты), что сопровождается выходом фермента в кровоток /44/. Поскольку максимальное количество АЛТ содержится в печени /54/, то при поражении клеток печени активность АЛТ в крови возрастает, хотя АЛТ является внутриклеточным ферментом, и его содержание в сыворотке крови здоровых людей невелико /41,44/. Поэтому определение активности фермента в сыворотке крови широко используется для диагностики болезней печени.

В мозге и сердце нами не было выявлено достоверных изменений в активности АЛТ, поскольку АЛТ является маркером периферической зоны катаболизма /55/, и его содержание в этих тканях мало, по сравнению например с печенью, изменение активности данного фермента не может быть индикатором тяжёлых нарушений происходящих в них, что мы не можем сказать об активности АСТ, которая повышалась в этих органах.

Наблюдаемое нами уменьшение активности АЛТ в почках может быть следствием того, что происходит ингибирование данного фермента ионами кадмия, можно предположить, что реакция переаминирования аланина при этом протекает медленнее, что приводит к снижению образования глутамата, который является одним из основных участников системы обезвреживания аммиака в организме. В результате в организме может происходить увеличение содержания аммиака в клетках, который является токсичным для организма и должен обезвреживаться, в этом принимает участие фермент АСТ (см. ниже).

Второй фермент, активность которого мы исследовали -АСТ - ключевой фермент обмена веществ, именно он обеспечивает поступление субстратов в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) /55/, занимая «центральную» роль в метаболизме. Субстраты этого фермента: аспартат, глутамат, пируват и б -кетоглутарат являются самыми древними и присутствуют у всех биологических объектов, занимая ключевую роль в обмене веществ. Значительная активность АСТ обеспечивает интенсификацию как поступления метаболитов в ЦТК, так и ускоряет работу последнего, что и ведёт к усилению окислительного фосфорилирования /47/.

В ходе нашего исследования было обнаружено увеличение активности АСТ в печени. Это увеличение можно объяснить тем, что в печени происходит усиленный синтез этого фермента, это может быть связано с тем, что происходит распад белков под действием ионов кадмия, что увеличивает содержание свободных аминокислот в организме, это «субстрат» для трансаминирования /46/. Снижение этого фермента в сыворотке крови говорит о связывании фермента по двум его активным центрам с его SH - группами, что наблюдается в значительном снижении активности /49/.

Увеличение активности АСТ в мозге, возможно, является компенсаторным на уменьшение синтеза глутамата в результате снижения скорости реакции катализируемой АЛТ /43/. Уменьшение синтеза глутамата приводит к повышению уровня аммиака в крови, который способен проникать через гематоэнцефалический барьер в головной мозг, где оказывает нейротоксический эффект /43/. Аммиак может усиливать нейротоксический эффект меркаптанов и короткоцепочечных жирных кислот концентрация которых может быть повышена в клетках печени при их поражении /49/. В астроцитах мозга аммиак обезвреживается в результате глутаматсинтазной реакции с образованием глутамина. Образование глутамина в астроцитах приводит к оттоку глутамата, который в результате усиления активности АСТ частично восстанавливает расход глутамата /55/. Когда происходит отток глутамата из малат-аспартатного челнока митохондрий происходит снижение синтеза АТФ, которую астроцит использует не только для внутренних потребностей, но и для снабжения ею нейронов, что приводит к гипоэнергетическому состоянию ЦНС. Увеличение активности АСТ приводит к увеличению образования глутамата, ответственного за связывания аммиака. Частичное обезвреживание аммиака происходит за счёт синтеза аспарагина из аспартата, являющимся одним из субстратов реакции трансаминирования /48/. Как было отмечено, отток глутамата сопровождается снижением синтеза АТФ что приводит к гипоэнергетическому состоянию, и это не может не изменить активности другого фермента ответственного за связывание аммиака в организме - глутаматдегидрогеназы, являющимся регуляторным механизмом обмена аминокислот. Понижение концентрации аденозиндифосфата (АДФ) активирует этот фермент, т. е. низкий энергетический уровень в клетках стимулирует разрушение аминокислот с образованием - кетоглутарата, часть которого связывается с аммиаком, а часть поступает в ЦТК как энергетический субстрат. Клетки мозга нуждаются в притоке энергии, они чувствительны к токсическому воздействию аммиака, в мозге помимо повышения активности АСТ существует множество механизмов обеспечивающих нормальное функционирование этой ткани.

Повышение активности АСТ в почках, возможно, связано с удалением ионов аммония образовавшегося при распаде белков, дезаминировании аминокислот /47,55/

Увеличение активности АСТ при заболеваниях сердца является диагностическим признаком в клинической практике /41/. Повышение активности АСТ в результате интоксикации, связано с адаптивным синтезом фермента /55/; возможно связано с необходимостью удаления избытков ионов аммония при поражении сердечной мышцы /50/.

В результате нашей работы наблюдалось увеличение активности АСТ и уменьшение активности АЛТ это может происходить и на оборот; возможно, это тонкий механизм, который организм исполняет при усилении или угнетении тех или иных процессов метаболизма, тем самым, адаптируя организм к неблагоприятным условиям. Как видно из результатов обсуждения эти ферменты играют не последнюю роль и в обезвреживании аммиака в организме, помимо своего основного участия в процессах обмена аминокислот.

Выводы

1. Показано, что введение лактирующим самкам крыс азотнокислого кадмия в дозе 0,5 мг/кг вызывает повышение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови, понижение активности - в гомогенатах печени и почек.

2. Установлено, что в дозе 2 мг/кг увеличения активности аланинаминотрансферазы не наблюдалось, тогда как в гомогенатах печени и почек она уменьшалась.

3. Выявлено повышение активности аспартатаминотрансферазы при введении экспериментальным животным азотнокислого кадмия в дозе 0,5 мг/кг в гомогенате сердца.

4. Установлено повышение активности аспартатаминотрансферазы при дозе 2 мг/кг в гомогенатах печени, головного мозга, почек и уменьшение в сыворотке крови.

Список использованных источников

Ярушкин В.Ю. Тяжелые металлы в биологической системе мать-новорожденный в условиях техногенной биогеохимическойпровинции // Гигиена и санитария - 1992. - №6. - с. 13-15.

Ревич Б.А. Экологическая эпидемиология, М.:Академия.,2004.- 206 с.

Wloch S. Dunamics of morphological and cytochtmical changel in the placenta following cadmium chloride intoxication // Ginecol. Pol. - 1992. - Vol. 63 - №6 - P. 264 - 275.

Corpas I., Antonio M T. Study of alteration produced by cadmium and cadmium/leand administration during gestational and early lactation periods in the reproductive organs of the rat // Ecotoxicol. Environ. Saf. - 1998. - Vol. 41 - №2 - P. 180-188.

5. Рапопорт С.М. Медицинская биохимия., М.:Медицина., 1966. - 143 с.

6. Алабастер Дж. Критерии качества воды для пресноводных рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность., 1984. - 344 с.

7. Куценко С.А. Основы токсикологии., Санкт - Петербург., 2002. - 390 с.

8. Ликулова И.В., Белова Е.А. Специфическое действие кадмия при перроральном поступлении в организм с водой. // Гигиена и санитария. - 1987. - №6. - с. 70-74.

9. Авцын А.П. и др. Микроэлементозы человека (этиология, классификация, органопатология)., М.:Медицина, 1991. - 564 с.

10. Ambrosi L., Lomonte C., Еtal Nephropathy induset in Nephrology, bari, Itali, apr. 1990. - 100 p.

11. Franchini I., Mutti A. Tubulointerstiliar nephropaties by industrial chemicals // Proceedings of the 4th Bari seminar in Nephrology, Bari., 1990. - p. 119-127.

12. Войнар А.И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека., М., 1960. - 245 с.

13. Дюга Г., Пенни К. Биологическая химия. Химические подходы к механизму действия ферментов., М., 1983. - 460 с.

14. Османов И.М. Роль тяжелых металлов в формировании заболеваний органов мочевой системы // Российский вестник перинетологии и педиатрии. - 1996. - №1. - с. 36-40.

15. Коротков С.А., Глазунов В.В., Действие гидрофобного органического комплекса кадмия на ионную проницаемость митохондриальной мембраны и дыхание митохондрий печени крыс. // Биохимические мембраны. - 1996. - №2. - с. 178-183.

16. Трахтенберг И.М., Иванова Л.А. Тяжелые металлы и клеточные метаболизмы. // Медицина труда и промышленная экология. - 1999. - №11. - с. 28-32.

17. Нурмухамбетов А.Н., Кащеева Е.П. Индукция кадмием перекисного окисления липидов в тканях белых крыс и ее профилактика аскорбиновой кислотой. // Гигиена и санитария. - 1989. - №3. - с. 77-78.

18. Скальный А.В. Микроэлементы человека (диагностика и лечение), М.: КМК., 1999. - 49 с.

19. Калоус В., Павличек З. Биофизическая химия., М.: Мир, 1985. - 446 с.

20. Gunarson D., Nordberg G., Cadmium - induced decrement of the receptor expression and c AMP levels in the testis of rats // Toxicology. - 2003. - Feb. 1:183(1-3) - p. 57-63.

21. Литвинов Н.Н. К вопросу о дозоэффективной зависимости эмбриотоксического действия хлористого кадмия. // Гигиена и санитария. - 1989. - №4. - с.86.

22. Мищенко В.П. Токсичные металлы и беременность. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 1997. - №6. - с. 59.

23. Antonio M. T., Lores N. Pb and Cd poisoning during development alters cerellar and striatal function in rats // Toxicjlogy. - 2002. - Iul. 1:176 (1-2) - p. 59-66.

24. Кретович В.Л. Введение в энзимологию., М., 1986. - 250 с.

25. Майстер А. Биохимия аминокислот. / Под. ред. А. Е. Браунштейна., М.: Издательство иностранной литературы., 1961. - 240 с.

26. Филиппович Ю.Б. основы биохимии., М., 1985. - 130 с.

27. Катунума Н. Химия и биология пиридоксалевого катализа., М., 1968. - 170 с.

28. Торчинский Ю.М. Молекулярный механизм энзиматического трансаминирования: 40-е Баховское чтение., М., 1987. - 70 с.

29. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.,(том 2), М., 1982. - 450 с.

30. Берхард С. Структура и функции ферментов., М., 1971. - 380 с.

31. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. / Пер. с анг. Ю.Б. Гребеньщикова., М., 1980. - 430 с.

32. Аминокислоты, их производные и регуляция метаболизма. / Под. ред. З.Г. Броновицкой., Ростов-на-Дону., 1983. - 124 с.

33. Мецлер Т. Биохимия. Химические реакции в живой клетке.(том 2), М., 1980. - 270 с.

34. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия., М.:Наука. - 2004. - 540 с.

35. Якубке Х.Ф., Аминокислоты, пептиды, белки. М., 1985. - 340 с.

36. Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции. / Под. ред. С.Е. Северина, Г.А. Кочетова, М.: Издательство МГУ, 1981. - 180 с.

37. Анисимов А.А. Медицинская энзимология., Горький., 1978. - 150 с.

38. Коровкин Б.Ф. Ферменты в жизни человека., М., 1972. - 270 с.

39. Халимов С.З. Сравнительная оценка эмбриотоксического действия различных соединений кадмия. // Гигиена и санитария. - 1985. - №4. - с. 11-14.

40. Reitman S., Frankel A. Colorimetric methol for the deter mination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminases. - Amer. I Clin. Pathol. - 1957. - №28. - p. 56-63.

41. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф. Биохимические исследования в клинике., М., 2001. - 215 с.

42. Рокицкий П.Р. Биологическая статистика., Минск., 1973. - 319 с.

43. Немова Н.С. Влияние аммиака и ацетилхолина на аспартат- и аланинаминотрансферазную активность ткани головного мозга. // Вопросы медицинской химии. - 1966. - №5. - с. 514-516.

44. Покровский А.А. Изменение активности сорбитдегидрогеназы, аланиаминотрансферазы и фосфогексоизомеразы в плазме крови крыс при остром токсическом поражении печени. // Вопросы едицинской химии. - 1967. - №5. - с. 511-515.

45. Корчак В.И. Активность аланинаинотрансферазы в сыворотке крови и печени в условиях воздействия на крыс химических веществ. // Гигиена и санитария. - 1985ю - №8. - с. 11-14.

46. Мосс Д.В., Баттерворт П.Д. Энзимология и медицина. М., 1978. - 365 с.

47. Талакин Ю.Н. О некоторых биохимических изменениях в организме при воздействии низких концентраций тяжелых металлов. // Гигиена и санитария. - 1973. - №9. - с. 17-19.

48. Люблина Е.И, Минкина Н.А. Адаптация к промышленным ядам как фаза интоксикации., Ленинград., - 1971. - 567 с.

49. Магарламов А.Г. Аспартат- и аланинаминотрансферазная активность в печени и сыворотке крови крыс при парентеральном азотистом питании на фоне белкового голодания. // Украинский биохимический журнал. - 1980. - №6. - с. 720-725.

50. Мушина Е.В. Изучение совместного биологического действия свинца и кадмия в эксперименте на животных. // Гигиена и санитария. - 1989. - №9 - с.89-90.

51. Охрименко С.М., Гурьева Н.Г. Адаптации ферментов липидного и азотистого обмена у крыс при оксидативном стрессе, вызванном стрессе, вызванном солями кобальта и ртути // Вестник Харьковского национального университета. - 2005. - №2. - с.56-60.

52. Филимонов К.Р. Лабораторная и инструментальная диагностика заболеваний внутренних органов. - М.: Наука, - 1995. - 342 с.

53. Kowalczyc E., Koff A. Effect of anthocyanins on selected biochemical parameters in rats exposed to cadmium // Acta Biochemica Polonica. - 2003. - Vol. 50. №2 - P. 543-548.

54. Надинская М.Ю. Печеночная энцефалопатия: патогенный подход к лечению. // Гостроэнтерология. - 2006. - №1. - с. 12-16.

55. Силиванов М.П. Клиническая биохимия.М.: Мир, 1984. - 543 с.

Страницы: 1, 2