Активность основных карбокмипептидаз в тканях пренатально алкоголизированных крыс

Активность основных карбокмипептидаз в тканях пренатально алкоголизированных крыс

1

2

АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ ПРЕНАТАЛЬНО АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М. Т.

ПЕНЗА 2003

• СОДЕРЖАНИЕ
• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………….……………….…...4
• ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….……5
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………….…...8
• 1.1. Влияние хронической алкоголизации на организм ……………………...8
• 1.2. Влияние пренатального хронического воздействия этанола на организм…………………………………………………………………..……..16
• 1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов …………………………...…21
• 1.3.1. Биологическая роль пептидаз…………………………….……………..21
• 1.3.2. Карбоксипептидаза Н…………………………………………………....23
• 1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза………….……..……………28
• 1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе…...…..….31
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….37
• 2.1. Материалы исследования…………………………………………..……...37
• 2.2. Методы исследования………………………………………………………37
• 2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола………………....37
• 2.2.2. Метод определения активности ферментов……………………….…..38
• 2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»…………………….……....39
• 2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования………………....40
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….……..…41
• 3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола...……….41
• 3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………..……………………….41
• 3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………….49
• 3.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола……………………...……………………..57
• 3.2.1. Исследование поведения пренатально алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»………………………………………………..…………57
• 3.2.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность карбоксипептидазы Н в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола………………………….……………………………..…..61
• 3.2.3. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола ……………………………..68
• ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ……………74
• ВЫВОДЫ…………………………………….…………………………………..88
• ЛИТЕРАТУРА….………………………………………………………………..91

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АПМЯК - аминопропилмеркаптоянтарная кислота

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

ВИП - вазоактивный интестинальный пептид

ВНД - высшая нервная деятельность

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГОМК - гамма-оксимасляная кислота

ГГС - гипоталамо-гипофизарная система

ГГГС - гипоталамо-гипофизарно-гонадная система

ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГПЯК - гуанидинопропилянтарная кислота

ГЭМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

КП - карбоксипептидаза

КПN - карбоксипептидаза N

КПВ - карбоксипептидаза В

КПН - карбоксипептидаза Н

КРФ - кортикотропин-рилизинг фактор

НАД - никотинамидаденин динуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

ПОМК - проопиомеланокортин

Р0, Р14, Р28, Р45, Р120 - возраст животных (0, 14, 28, 45 и 120 суток после рождения, соответсвенно)

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ФМСФ-КП - фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилдиаминтетраацетат натрия

Для современной биологии и медицины имеет особую значимость исследование общих и частных закономерностей развития алкоголизма. Решение указанных вопросов позволит раскрыть патогенетические механизмы этого заболевания и разработать эффективные способы его профилактики и лечения.

Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме потомков алкоголиков, и формирования у них предрасположенности к алкоголизму. При этом вызывают интерес процессы, происходящие в онтогенезе. Известно, что в ходе индивидуального развития организма происходит зависящая от пола перестройка различных функциональных и, особенно, регуляторных систем: нервной и эндокринной [12]. Эта перестройка сопровождается значительными изменениями в функционировании пептидергических систем, например опиоидных, что, несомненно, связано с изменением активности ферментов, участвующих в обмене биологически активных пептидов [1, 25, 52, 55, 76, 212, 278].

Биологически активные пептиды функционируют в качестве гормонов, нейрогормонов, нейромодуляторов, нейромедиаторов [76], вовлекаясь в регуляцию практически всех процессов, протекающих в организме, а также в развитие многих патологических процессов [76, 120]. Известна роль многих регуляторных пептидов, особенно опиоидных пептидов, в патогенезе алкоголизма [7, 13, 18, 62, 69, 120, 128, 272].

Уровень биологически активных пептидов в организме во многом зависит от активности ферментов, участвующих в процессинге их предшественников, модуляции и инактивации [35, 48, 52, 56, 115, 126, 140, 142, 160, 172, 174, 205].

К ферментам, участвующим в метаболизме регуляторных пептидов, относятся, в частности, основные карбоксипептидазы - это экзопептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов. К ним относятся карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17.1 ), карбоксипептидаза Н (КФ 3. 4. 17. 10), карбоксипептидаза М (КФ 3. 4. 17. 12), карбоксипептидаза N (КФ 3. 4. 17. 3), лизосомальная карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17. 2), ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза и некоторые другие.

На настоящий момент возрастные и половые изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов, происходяшие в онтогенезе у потомков алкоголиков не изучены. Также нет данных об изменениях активности этих ферментов у пренатально алкоголизированных особей при последующем воздействии этанола в постнатальном периоде.

Целью нашей работы было изучение роли основных карбоксипептидаз в развитии предрасположенности к формированию алкогольной зависимости у потомков алкоголиков.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

Исследовать активность карбоксипептидаз Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных животных разного возраста.

Исследовать влияние хронической постнатальной алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию этанола в эмбриональном периоде жизни.

Сравнить влияние алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП у животных разного пола.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние пренатальной алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП в тканях самок и самцов крыс. При этом исследована ферментативная активность как у взрослых животных, так в период их полового созревания. Установлена зависимость изменения активности КПН и ФМСФ-КП от пола и возраста животных. Показано половое отличие изменения активности ферментов в тканях пренатально алкоголизированных животных при постнатальной хронической этанольной интоксикации.

Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и роли основных карбоксипептидаз в норме и при алкоголизме.

Положения, выносимые на защиту:

На основе анализа возрастной динамики, регионального распределения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и сравнения их с уровнем биологически активных пептидов, обсуждается биохимическая функция данных ферментов.

Пренатальная алкоголизация вызывает изменение активности исследованных ферментов в мозге и периферических тканях животных обоего пола в процессе развития.

Пренатальная алкоголизация модулирует изменение активности КПН и ФМСФ-КП при последующей постнатальной алкоголизации взрослых особей.

Предложена гипотетическая схема одного из возможных механизмов формирования предрасположенности к алкоголизму у пренатально алкоголизированных особей с участием исследованных ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-ой Всеросийской научно-практической конференции (Волгоград, 2003) и итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Пензенского Государственного Педагогического Университета (2002, 2003 г.г.). По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами. Список литература содержит 353 наименования на русском и иностранных языках.

Эндогенные этанол и ацетальдегид являются одной из важных метаболических систем организма животных и человека, обмен этих веществ - неотъемлемая часть систем поддержания гомеостаза [21, 24, 63, 71, 92, 176, 184, 314, 329].

Экзогенный этанол, поступающий в организм животных и человека, окисляется тремя ферментативными системами: 1) алкогольдегидрогеназой с участием НАД, метаболизирующей 75-90 % поступившего этанола; 2) микросомальной этанолокисляющей системой с участием НАДФ и О2, окисляющей ~ 10 % этанола; 3) каталазой, окисляющей ~ 2 % этанола [78, 81, 82, 89, 336].

При хронической алкоголизации происходит изменение активности ферментов окисления этанола, что приводит к нарушению баланса между образованием и утилизацией ацетальдегида, что в свою очередь существенно сдвигает уровень ацетальдегида в крови [14, 24, 58, 97].

Важно отметить существование половых генетических отличий активности ферментов, участвующих в метаболизме этанола [15, 22, 105, 107, 197].

Этанол и его метаболиты влияют на белки нервной ткани, печени, крови, сердца и др. тканей [98].Отмечаются зависящие от дозы и длительности воздействия этанола, нарушения белкового синтеза и катаболизма [112]. Эти изменения отличаются в различных отделах мозга и субклеточных структурах [2, 23, 61].

Формирование алкоголизма сопряжено с нарушением ряда физиологических функций, в регуляции которых значительную роль играют эндогенные олигопептиды. Выявлено участие отдельных олигопептидов (окситоцина, вазопрессина, нейротензина, бомбезина, дельта-сон-индуцирующего пептида, холицистокинина, опиоидных пептидов, АКТГ и др.) в развитии толерантности и физической зависимости от этанола, а также в формировании алкогольного абстинентного синдрома. Установлено участие биологически активных пептидов (ангиотензина-ІІ, брадикинина, в-эндорфина, энкефалинов и дельта-сон-индуцирующего пептида) в механизмах формирования и реализации алкогольной мотивации [65]. Так, известно, что хронический этанол усиливает секрецию АКТГ и пролактина и снижает секрецию соматотропного гормона [3, 297], увеличивает экспрессию мРНК КРФ в гипоталамусе [297], увеличивает концентрацию КРФ и АКТГ в ГГС [98]. По другим данным [296] хроническая алкоголизация снижает содержание КРФ в гипоталамусе. Также отмечается повышаение уровеня мРНК препротахикинина в вентральной оболочке, без изменения его в стритуме [260], нарушение синтеза в мозге дельта-сон-индуцирующего пептида [24]. Ацетальдегид стимулирует синтез КРФ и экспрессию мРНК аргинин-вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса [228].

Особо важно отметить влияние этанола на эндогенную опиоидную систему организма и ее участие в патогенезе алкоголизма. Причастность опиоидных пептидов к реализации эйфорического эффекта, эмоционального восприятия, условнорефлекторной и других форм ВНД с одной стороны, и предположения о реализации через пептидергические нейроны, эпилептиморфных свойств этанола, а также характерных для синдрома алкогольной абстиненции тремора, судорог и галлюцинаций с другой, свидетельствуют о существенной роли опиоидных пептидов в патогенезе алкоголизма [80].

Установлено, что хроническое употребление алкоголя заметно снижает плотность и сродство опиатных рецепторов к своим природным лигандам [79, 133, 135]. Отмечается влияние эстрадиола и прогестерона на этот эффект этанола в гипоталамусе, среднем мозге и коре, что частично объясняет половые отличия алкогольных эффектов [133].

При хронической алкогольной интоксикации снижается содержание некоторых опиоидных пептидов в отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348], что является отражением процесса адаптации опиоидной системы к избыточной стимуляции, приводящей к снижению функциональной активности этой системы [9, 18, 84].

Обращает на себя внимание несогласованное снижение уровней разных опиоидных пептидов под действием хронической алкоголизации в разных отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348] и данные даже об увеличении концентрации в-эндорфина [98] и экспрессии мРНК ПОМК [228]. Панченко Л. Ф. с соавт. [80] считают, что с такого дисбаланса в опиоидной системе мозга начинается формирование зависимости и толерантности к алкоголю, далее в процесс вовлекаются сопряженные с ней нейромедиаторные и нейромодуляторные системы мозга, что нарушает слаженную работу мозга в целом. Абстинентный синдром усугубляет опиоидный дефицит [125, 198].

Опосредование механизмов действия этанола на организм через нейропептиды подтверждается также данными о влиянии биологически активных пептидов на потребление алкоголя и изменение ими эффектов, вызванных этанолом. Так холецистокинин, бомбезин [235, 233], тиролиберин [234], кортикотропин-рилизинг фактор [120], ангиотензин ІІ, брадикинин, Leu-энкефалин, энкефалиноподобный тетрапептид, дельта-сон-индуцирующий пептид [65], Met-энкефалин [54] снижают потребление алкоголя; вазоактивный интестинальный полипептид, нейропептид Y, галанин, в-эндорфин увеличивают потребление этанола [235]; вещество Р частично нормализует нарушенные этанолом центральные механизмы реакции избегания [60;].

Важным хроническим действием этанола на нейропептиды является изменение активности различных ферментов их обмена [11, 67, 211, 324, 332].

Отмечается увеличение активности КПН в гипофизе [28, 32, 45], гипоталамусе и стриатуме крыс [28, 32]; уменьшение активности АПФ в гипоталамусе и стриатуме [28]. Хроническая алкоголизация и ее отмена увеличивают активность АПФ в гипофизе и стриатуме немурицидных крыс и в гипофизе мурицидных крыс [53]; увеличивают активность КПН в гипофизе, стриатуме и среднем мозге у немурицидных крыс [53]. Исходно различная активность ферментов в мозге для мурицидных и немурицидных крыс выравнивается в процессе потребления этанола и его отмены до уровня, характерного для мурицидных крыс [53].

Совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН в гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге крыс [32].

Хроническое воздействие этанола повышает активность КПН в гипофизе и стриатуме предпочитающих воду и предпочитающих этанол крыс и снижает ее в гипоталамусе и таламусе предпочитающих воду крыс; увеличивает карбоксипептидазо-В подобную активность в среднем мозге и стриатуме крыс; увеличивает активность АПФ в гипофизе и стриатуме и снижает в гипоталамусе и таламусе предпочитающих воду крыс [54].

Активность этих ферментов (КПН, АПФ) изменяется в направлении, которое способствует повышению уровня биологически активных пептидов [28].

Хроническая алкоголизация вызывает повышение активности ферментов, участвующих в метаболизме в-эндорфина в среднем и переднем мозге мышей [146], увеличение активности энкефалинконвертазы А в среднем мозге, гипоталамусе и стриатуме крыс [19].

По данным Беляева Н. А. с соавт. [20] хроническая алкоголизация вызывает в коре больших полушарий снижение удельной активности растворимой и мембраносвязанной форм энкефалинконвертазы, а в стриатуме - снижение удельной активности растворимой и увеличение активности мембраносвязанной формы фермента. Привлекает внимание, что, и изменение общей ферментативной активности имеет сходную направленность. Нарушения, происходящие при хронической алкоголизации, могут быть вызваны как снижением способности фермента гидролизовать субстрат, так и совместным изменением каталитических свойств фермента и его содержания в соответствующем биологическом образце. Авторы полагают, что изменение активности фермента происходит из-за нарушения метаболизма фермента, а в случае мембраносвязанной формы фермента, возможно, и изменения липидного состава нейрональных мембран.

Следует подчеркнуть, что максимальное изменение активности энкефалинконвертазы, КПН, АПФ и др. ферментов обмена нейропептидов обнаружены в среднем мозге, гипоталамусе, стриатуме - отделах, имеющих наиболее важное значение для развития толерантности к алкоголю и зависимости от него. Представляется вероятным вовлечение этих ферментов в патогенез алкоголизма.

Некоторые противоречия данных, касающихся изменения активности ферментов обмена нейропептидов и несогласованность с изменением уровня нейропептидов, в частности, Leu-энкефалинов и Met-энкефалинов в зонах мозга животных и человека, длительно потребляющих этанол, значительно зависят от сроков и формы применявшейся нагрузки этанолом (с пищей, искусственное введение внутрь, добровольное потребление) [12, 54]. Отмечается так же, что количество определяемого пептида является, по сути, интегративной величиной соотношения нейропептидобразующей и нейропептиддеградирующей активности в конкретном нейрональном регионе. Непосредственное определение активности пептидаз, проведенное в единичных исследованиях показывает неоднозначность таких изменений, трактовка которых представляется затруднительной.

При хронической алкоголизации в мембранах клеток происходит уменьшение степени ненасыщенности липидов мембран, увеличение в мембранах содержания холестерина, уменьшение количества мембраносвязанных аминогликанов. Эти физико-химические изменения, не зависящие от тканевой принадлежности клеток (кровь, печень, центральная нервная система), позволяют компенсировать флюидизирующее действие этанола и лежат в основе механизмов развития толерантности клеток к воздействию этанола при его хроническом потреблении [12].

Изменения фазового состояния мембраны оказывают существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мембраносвязанных ферментов [51, 91, 252, 265].

Анализ функционального состояния ГГНС у здоровых и страдающих алкоголизмом людей, а также данные, полученные в экспериментах на разных животных под влиянием хронической алкогольной интоксикации, свидетельствуют о выраженном влиянии этанола на разные компоненты этой системы [24, 66].

При хронической алкоголизации наблюдается изменение функционирования ГГНС. Вначале происходит нарушение на уровне гипоталамуса и гипофиза. Это приводит к гиперсекреции АКТГ, который действует на клетки коры надпочечников, стимулируя синтез кортикостероидов [24, 123, 222, 276, 320, 321]. Затем фаза первичного повышения секреции этих гормонов сменяется развитием толерантности, адаптации ГГНС к стимулирующему действию этанола [24, 122, 209, 321]. Причем снижение функционирования ГГНС, наблюдаемое у экспериментальных животных носит возрастозависимый характер [189, 345]. Развитие относительной недостаточности адренокортикальной функции при алкогольной интоксикации обусловлено прямым токсическим действием алкоголя и продуктов его метаболизма на продукцию глюкокортикоидов в надпочечниках и влиянием на процессы биосинтеза и высвобождения АКТГ в гипофизе, а также на нейротрансмиттерные системы, регулирующие синтез и высвобождение кортиколиберина в гипоталамусе [24].

Кроме АКТГ, хроническая алкоголизация влияет и на другие пептиды ГГНС [276, 290, 304].

Хроническая алкоголизация снижает уровень лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в плазме крови у самок и самцов крыс [298, 305]. У самцов при этом в гипофизе не изменяется концентрация этих гормонов и гонадотропин-рилизинг гормона, но снижается количество пролактина. В семенниках снижается содержание рецепторов лютеинизирующего гормона, повышается содержание рецепторов фолликулостимулирующего гормона и не изменяется содержание рецепторов пролактина и гонадотропин-релизинг гормона [305].

Отмечаются половые отличия в формировании алкогольной зависимости.

В процессе развития экспериментального алкоголизма уровень потребления этанола выше у самок крыс по сравнению с самцами, хотя предпочтение быстрее формируется у самцов [106, 141, 214, 294]. В то же время есть данные о том, что самцы макак пьют больше, чем самки [343]; крысы обоего пола потребляют этанол в одинаковых количествах, но у самок дольше поддерживается предпочтение к этанолу [113]. У самцов мышей выше, чем у самок, чувствительность к хроническому седативному гипнотическому действию этанола [293]. У самок крыс при более медленном развитии зависимости от этанола происходит более быстрое восстановление, чем у самцов [148]. У женщин отмечается более высокий уровень алкоголя в крови, чем у мужчин при приеме одинакового количества этанола [186, 337]. У людей обоего пола уровень потребления алкоголя зависит от генотипа [106, 306, 320] и возраста [306].

Установлено, что у самок животных выше чувствительность к вызванному алкоголем повреждению печени, а также чаще встречается полинейропатия и мозжечковая атаксия, чем у самцов [337].

Во время отмены этанола после его хронического потребления ЦНС самок крыс по сравнению с самцами более восприимчива к повреждению полиаминовых нейронов [288], более чувствительна к антиконвульсантному действию нейростероидов [149], и проявляет больший ответ на острое введение этанола [148]. Однако приводятся данные о меньшей чувствительности самок к отмене этанола, что частично объясняется влиянием эстрогена [215]. Влиянием половых гормонов также можно объяснить и другие факты половых отличий при абстинентном синдроме [216, 217].

Хроническое потребление алкоголя самками изменяет соотношение стадий эстрального цикла, что свидетельствует о нарушении гипоталамических гормональных функций. У самок животных, по сравнению с самцами, отмечаются более выраженные изменения в кинетике этанола и ацетальдегида, что также способствует потреблению высоких доз этанола [4]. При развитии алкоголизма у самцов важна система положительного подкрепления мозга, а у самок - система, метаболизирующая этанол [4]. В частности имеются данные о половых отличиях экспрессии и стимуляции изоферментов АДГ [105, 215], причем в механизм этих отличий вовлекаются андрогены, оказывающие ингибирующее действие, а также прогестерон и эстроген, оказывающие стимулирующее действие [197]; алкоголизация не изменяет активность АДГ печени у животных обоего пола, но с повышением потребления этанола активность обоих изоферментов повышается.

Страницы: 1, 2